Ionenchromatographie für die pharmazeutische Industrie

Die Ionenchromatographie (IC) ist eine Analysentechnik zur Trennung und Quantifizierung ionischer und polarer Substanzen. Die Ionenchromatographie hat sich in der Pharmaindustrie und bei den Aufsichtsbehörden als vielseitiges Werkzeug etabliert, das unter anderem zur Untersuchung der Wasserqualität und für verschiedene chemische Analysen eingesetzt wird. In den letzten Jahren hat sie zudem an Bedeutung für die Analyse von Arzneimittel gewonnen. Die United States Pharmacopeia-National Formulary (USP-NF, US-Arzneibuch (USP)), das maßgebliche Normungsgremium für (bio-)pharmazeutische Produkte, hat das Potenzial der IC im Zuge ihrer Modernisierungsmaßnahmen erweitert und sie als geeignete und gültige Technik in ihren General Chapters, Assays und Verunreinigungstests etabliert.

Dieser Artikel gibt eine kurze Einführung in die Prinzipien der Ionenchromatographie und erörtert dann die Anwendungen und Vorteile ihrer Verwendung für die pharmazeutische Analyse auf der Grundlage des USP General Chapter <1065> Ionenchromatographie.

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• Was ist Ionenchromatographie?
• Warum ist die Ionenchromatographie für die pharmazeutische Industrie wichtig?
• IC-Detektionstechniken und ihre Anwendungen gemäß USP <1065>

Was ist Ionenchromatographie?

Die Ionenchromatographie ist eine Form der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), die zur gleichzeitigen Trennung und Quantifizierung von ionischen und polaren Analyten verwendet wird, wobei meist ein Ionenaustausch als Trennmechanismus eingesetzt wird [1-3] (Animation 1).

In den meisten Anwendungen wird eine Ionenaustausch-Trennsäule mit einem Leitfähigkeitsdetektor kombiniert. Es ist jedoch auch gängig, andere Detektionsverfahren wie UV/VIS, amperometrische Detektion oder die Kopplung mit Massenspektrometern zu nutzen [3,4]. Die wesentlichen Bestandteile eines Flüssigchromatographiesystems sind in Abbildung 1 dargestellt. Dazu zählen eine Hochdruckpumpe mit einem Reservoir für die mobile Phase (Eluent), ein Injektor (Probenaufgabe), eine Trennsäule (analytische Säule) und das Detektionssystem (einschließlich Derivatisierung, Datenerfassung und Datenverarbeitung).

Erfahren Sie mehr über die Entwicklung der Ionenchromatographie bei Metrohm und ihre zahlreichen Detektionstechniken mit diesen Materialien.

Blog-Beitrag: Geschichte von Metrohm IC – Teil 1

Monographie: Ionenchromatographie

Monographie: Praktikum der Ionenchromatographie – Eine Einführung

Warum ist die Ionenchromatographie für die Pharmaindustrie wichtig?

Auch wenn HPLC-Ansätze die Methoden der Flüssigkeitschromatographie in der Pharmaindustrie dominieren, hat sich auch die IC weitgehend durchgesetzt. Die Vorteile der IC gegenüber anderen flüssigchromatographischen oder traditionellen Methoden wie der Titration für die pharmazeutische Industrie können wie folgt zusammengefasst werden [5,6]:

• Analyse mehrerer Analyten in einem Lauf
• speziell für ionische und polare Analyten
• metallfreier Fließweg  
• Eluenten basieren auf Salzen, schwachen Säuren oder schwachen Basen
• Suppression (Animation 2) für niedrige Basislinien und niedriges Signal-Rausch-Verhältnis, wodurch die analytische Sensitivität verbessert wird
• flexible Geräteausstattung: verschiedene Detektoren (z. B. Leitfähigkeit, UV/VIS, amperometrische Detektion oder Kopplung mit Massenspektrometern), ein hoher Automatisierungsgrad für maximale Effizienz und niedrige Betriebskosten (z. B. Optionen zur Inline-Probenvorbereitung oder Einzelstandardkalibrierung) 

IC als validierter Ansatz für USP-NF-Standards

Als eine der treibenden Kräfte bei der Standardisierung pharmazeutischer Methoden gewährleistet die USP-NF die Qualität, Sicherheit und Wirksamkeit von Arzneimitteln im Rahmen des Herstellungsprozesses und ihrer Anwendung [6,7]. Die USP-NF-Normen haben eine lange Geschichte - über 200 Jahre [6]. Neue Qualitätskriterien und Technologien unterstützten jedoch 2010 eine globale Modernisierungsinitiative der FDA (U.S. Food and Drug Administration) und der USP-NF.

Die IC als methodischer Ansatz für die Analyse von Spurenverunreinigungen, Hilfsstoffen, pharmazeutischen Wirkstoffen (APIs), Metaboliten und Abbauprodukten sowie ionischen Komponenten in pharmazeutischen Lösungen und Körperflüssigkeiten [5,8-15] wurde in zahlreichen USP-Kapiteln, Assays, Verunreinigungs- und Identifizierungstests zu einem validierten Verfahren. Dabei hat die IC teilweise traditionelle Methoden (z. B. Titration) ersetzt oder wurde in neue Normen aufgenommen, die sich auf die Verwendung von Methoden nach dem Stand der Technik konzentrieren.

Die Grundlagen der chromatographischen Techniken sind in den General Chapters <621> und <1065> der USP beschrieben [16,17]. In diesen General Chapters werden Einzelheiten zur Methodik und zum Gesamtaufbau sowie die wichtigsten Parameter und Anforderungen an die Genauigkeit und Zuverlässigkeit chromatographischer Methoden in der pharmazeutischen Analyse beschrieben.

USP Allgemeine Kapitel <621> und <1065>: Kernprinzipien und Grundlagen der Chromatographie

Das General Chapter <621> der USP gibt einen Überblick über verschiedene chromatografische Techniken mit Definitionen von Geräten und Verfahren (z. B. mobile Phase, Säule, Elutionsarten, Methodenverfahren), gemeinsamen Parametern und Anforderungen für die Prüfung der Systemeignung (z. B. Systemreproduzierbarkeit, Systemempfindlichkeit und Peakperformance) [16]. Die Klassifizierung von Chromatographiesäulen wird auch mit einer Liste von Packungen (L-Nummern), Phasen (G) und Trägern (S) erläutert, die als Referenz für Chromatographen dienen [18].

Die L-Nummern für ionenchromatographische USP-Ansätze und Erkenntnisse über das Säulenäquivalenzverfahren werden im folgenden Artikel erläutert.

Blogbeitrag: Anwendung von USP-validierten Methoden zur Äquivalenz von Trennsäulen

Andererseits bietet das USP General Chapter <1065> einen umfassenden Überblick über die IC [16,17] und ihre Bedeutung als anerkanntes Testverfahren zur Identifizierung und Quantifizierung spezifischer Analyten (Assays und Verunreinigungen). Die Ionenchromatographie ist in vielen Fällen ein geeignetes Charakterisierungsverfahren und eignet sich für alle Bereiche pharmazeutischen Produktion [8,17]. Ihr Anwendungsbereich ist breit gefächert und umfasst die Qualitätskontrolle von Rohstoffen, Arzneimitteln oder formulierten Produkten sowie die Beurteilung von Prozesswässern für die Herstellung, Kulturmedien, Reinigungslösungen oder Abwasserströmen [17]. USP <1065> enthält grundlegende Kenntnisse über diese Technik: was Ionenchromatographie ist, Einzelheiten zur Instrumentierung (Abbildung 1), gängige Detektionstechniken, Verfahren und wichtige Hinweise für die Entwicklung geeigneter Methoden.

Detailliertere Informationen zu den Kriterien und Anforderungen für die Methodenvalidierung finden sich im General Chapter <1225> zur Validierung von Kompendienverfahren. Dazu gehören Systemeignungstests, die sicherstellen, dass das IC-System vor der Analyse ordnungsgemäß funktioniert, indem Parameter wie Auflösung, Retentionszeit und Peakform bewertet werden. Außerdem werden Anforderungen an die Validierung mit Schlüsselparametern wie Linearität, Genauigkeit, Präzision, Spezifität, Nachweisgrenze (LOD) und Bestimmungsgrenze (LOQ) beschrieben [19]. Generell ist es bei der Entwicklung einer IC-Methode sehr wichtig, geeignete mobile und stationäre Phasen auszuwählen (Abbildung 1), um eine effiziente Trennung sowie eine angemessene Selektivität und Empfindlichkeit zu gewährleisten (Anforderungen gemäß USP <1225>) [17,19]. Mobile Phasen bestehen in der Regel aus verdünnten Säuren, Basen oder Salzen, die in hochreinem Wasser gelöst sind, während stationäre Phasen entweder aus Materialien auf Siliziumdioxid- oder Polymerbasis bestehen können.

Aufgrund ihrer Bedeutung sind Säulen und geeignete mobile Phasen in den Monographien und General Chapters der USP verankert. Die Säulenäquivalenz lässt den Anwendern jedoch eine gewisse Freiheit bei der Implementierung der Methode in den analytischen Arbeitsablauf.Erfahren Sie mehr über IC-Säulen in unserer Blogbeitrag-Serie:

Blogbeitrag: Best Practice für Trennsäulen in der Ionenchromatographie (IC) – Teil 1

IC-Detektionstechniken und ihre Anwendungen gemäß USP <1065>

In diesem Abschnitt werden vier häufig verwendete IC-Detektionsmethoden erläutert (Klicken Sie unten, um zu einem Thema zu springen):

• Leitfähigkeitsdetektion
• UV/VIS-Detektion
• amperometrische Detektion
• IC gekoppelt mit Massenspektrometrie

Leitfähigkeitsdetektion

Die gebräuchlichste IC-Detektionsmethode ist die Leitfähigkeit [17]. Das Prinzip – basierend auf der Konduktometrie – ist in der Animation 3 dargestellt [2]. Die Leitfähigkeitsdetektion misst, wie gut die Ionen in einer Lösung elektrischen Strom zwischen zwei Elektroden leiten und liefert Informationen über die Konzentration der vorhandenen Ionenarten. In Kombination mit einem Suppressor wird das Hintergrundsignal reduziert und die Empfindlichkeit und das Signal-Rausch-Verhältnis deutlich verbessert (Animation 2) [2,17].

Die IC mit Leitfähigkeitsdetektion hat ein breites Anwendungsspektrum für die pharmazeutische Analyse, einschließlich:

Die Besonderheit der IC liegt in der Bestimmung mehrerer Analyten in einem Lauf, wie z. B. für mehrere anionische Analyten (Acetat, Chlorid, Citrat und Sulfat in einer Infusionslösung; AN-N-051) oder für kationische Komponenten (Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium in einer Tropfnahrung; AN-C-022). Dank hochkapazitiver IC-Säulen ist die Trennung von Analyten auch in den stärksten Matrices möglich [7].

UV/VIS-Detektion

UV/VIS ist eine optische Detektionstechnik, die direkt, indirekt oder mit Nachsäulenderivatisierung verwendet werden kann. Sie eignet sich zur Detektion von Ionen, die UV/VIS-Licht absorbieren [2,17].

Die Direkte UV-VIS-Detektion wird neben der Leitfähigkeitsdetektion z. B. zur Bestimmung von Ionen eingesetzt, die im UV-Bereich stark absorbieren (Nitrit, Nitrat, organische Anionen), um deren Nachweisbarkeit in Gegenwart hoher Konzentrationen anorganischer Ionen (Chlorid, Phosphat, Sulfat), die kein oder nur ein geringes UV-Absorptionsvermögen besitzen, zu verbessern [2]. Das Prinzip dieser Nachweismethode ist in Animation 4 dargestellt.

Für die indirekte UV-Detektion werden Eluenten mit hoher Absorption im sichtbaren oder ultravioletten Spektralbereich verwendet (z. B. Phthalatpuffer) [17]. Die Detektionswellenlänge wird so gewählt, dass das Eluent absorbiert, die Probenionen jedoch nicht. Diese Wahl führt zu negativen Peaks, die proportional zur Analytkonzentration sind.

Amperometrische Detektion

Die amperometrische Detektion ist eine elektrochemische Analysemethode, bei der der durch die Oxidation oder Reduktion von Analyten an einer Arbeitselektrode erzeugte Strom als Funktion der Zeit gemessen wird [20] (Animation 5). 

Eine Voraussetzung ist, dass die Zielionen entweder reduzierbar oder oxidierbar, also elektroaktive Substanzen sind [2,17]. Beispiele für Analyten umfassen organische Verbindungen, Übergangsmetalle, Anionen (z. B. Nitrit, Nitrat, Sulfid, Sulfit) oder Kohlenhydrate [2]. Einige Beispiele für den Einsatz von IC mit amperometrischer Detektion in der Pharmaindustrie ist die Bestimmung von Laktose (in Milchprodukten und Nahrungsergänzungsmitteln, AN-P-089), Katecholamine (in einer pharmazeutischen Injektionslösung, AN-P-053), Gentamicin (in Gentamicin-Lösung, AN-P-080) und Propylenglykol (in topischer Diclofenac-Lösung, AN-P-076).

Unser Whitepaper beschreibt die Bestimmung von Polyribosylribitolphosphat (PRP) in einem Haemophilus influenzae Impfstoff mittels IC mit gepulster amperometrischer Detektion (Abbildung 4). 

Die schwarze Linie im Chromatogramm zeigt einen Standard mit einer Konzentration von 3 µg/ml PRP. Die blau-grüne Linie zeigt den Gesamt-PRP-Gehalt (Endkonzentration 19,42 mg/L) an, der innerhalb von 80-120 % des angegebenen Wertes (16-24 mg/L) liegt. Gemäß den Qualitätskriterien muss das freie PRP weniger als 20 % des gesamten PRP-Gehalts betragen. Die Probe (lindgrüne Linie im Chromatogramm) zeigt den ermittelten Gehalt an freiem PRP (2,03 mg/L Endkonzentration) und entspricht den Anforderungen.

Kopplung von Ionenchromatographie und Massenspektrometrie

Die Ionenchromatographie kann mit Massenspektrometern kombiniert werden, um die Nachweisempfindlichkeit für organische Säuren, Kohlenhydrate oder Spurenelemente zu erhöhen. Die inerte Instrumentierung bietet Flexibilität bei der Wahl der mobilen Phase und schützt vor Verunreinigungen, was besonders für die Speziation von Spurenelementen wichtig ist. Die IC-Suppressionstechnik stellt sicher, dass die Flüssigkeit, die in diese hochempfindlichen Massenspektrometer gelangt, nur Analyten und Wasser (und möglicherweise einige organische Modifier) enthält. Dies trägt zu stabilen Betriebsbedingungen, einer erhöhten die Empfindlichkeit der Analyse und einer längeren Lebensdauer des Geräts bei.

Weitere Informationen zur Kopplung von IC mit MS finden Sie in unserer Literatur:

Kopplung von Ionenchromatographie und Massenspektrometrie

Whitepaper: Eine Einführung in die Ionenchromatographie-Massenspektrometrie (IC-MS)

Fazit

Die Ionenchromatographie ist ein leistungsstarkes, vielseitiges Analysegerät für pharmazeutische Anwendungen. Sie kann eine Vielzahl von Probentypen verarbeiten und zeichnet sich durch ihre hohe Empfindlichkeit beim Nachweis ionischer und ionisierbarer Substanzen aus. Die Fähigkeit, die Ionenchromatographie mit verschiedenen Nachweissystemen zu koppeln, macht sie in der pharmazeutischen Produktion und bei der Qualitätskontrolle besonders wertvoll.

Ihre Wissens-Take-aways

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Blogbeitrag: Anwendung von USP-validierten Methoden zur Äquivalenz von Trennsäulen

Whitepaper: Wenn die HPLC versagt: IC in der Lebensmittel-, Wasser- und Pharmaanalyse

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