Cromatografia iônica para a indústria farmacêutica

A cromatografia iônica (CI) é uma técnica analítica usada para separar e quantificar analitos iônicos e polares. O CI se tornou amplamente aceito pela indústria farmacêutica e órgãos reguladores para uma gama expandida de aplicações, como qualidade da água e análise química. Nos últimos anos, ela se qualificou para analisar produtos farmacêuticos. Farmacopeia dos Estados Unidos - Formulário Nacional (USP-NF, Farmacopeia dos EUA (USP)), o principal órgão de padronização de produtos (bio)farmacêuticos, aumentou o potencial do CI durante suas abordagens de modernização, estabelecendo-o como uma técnica apropriada e válida em seus Capítulos Gerais compendiais, ensaios e testes de impurezas.

Este artigo apresenta brevemente os princípios da cromatografia iônica e, em seguida, discute as aplicações e os benefícios de seu uso para análises farmacêuticas com base no Capítulo Geral <1065> da USP sobre Cromatografia Iônica.

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• O que é cromatografia iônica? 
• Por que a cromatografia iônica é importante para a indústria farmacêutica?
• Técnicas de detecção de IC e suas aplicações de acordo com USP <1065>

O que é cromatografia iônica?

A cromatografia iônica é um tipo de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) usada para separar e quantificar analitos iônicos e polares simultaneamente, geralmente usando a troca iônica como mecanismo de separação [1–3] (Animação 1). 

A combinação de colunas de separação de troca iônica e detecção de condutividade representa a maioria das aplicações de CI, mas o uso de outras técnicas de detecção, como UV/VIS, detecção amperométrica ou hifenização com espectrômetros de massa, também é comum [3,4]. Os principais componentes de uma configuração de cromatografia líquida são mostrados em Figura 1. Isso inclui uma bomba de alta pressão com armazenamento de fase móvel (eluente), injetor (introdução de amostra), coluna de separação (coluna analítica) e o sistema de detecção (incluindo derivatização, aquisição de dados e processamento de dados). 

Saiba mais sobre o desenvolvimento da cromatografia iônica na Metrohm e suas diversas técnicas de detecção com esses materiais relacionados.

Postagem do blog: História do Metrohm IC – Parte 1

Monografia: Cromatografia iônica

Monografia: Cromatografia iônica prática – Uma introdução

Por que a cromatografia iônica é importante para a indústria farmacêutica?

Mesmo que as abordagens de HPLC dominem os métodos de cromatografia líquida na indústria farmacêutica, a IC também se tornou amplamente aceita. As vantagens do IC sobre outros métodos cromatográficos líquidos ou tradicionais, como a titulação para a indústria farmacêutica, podem ser resumidas da seguinte forma [5,6]:

• análise de múltiplos analitos em uma execução
• dedicado para analitos iônicos e polares
• caminho de fluxo livre de metal  
• eluentes são baseados em sais, ácidos fracos ou bases fracas
• supressão (Animação 2) para baixa linha de base e baixa relação sinal-ruído, melhorando a sensibilidade analítica
• instrumentação flexível: vários detectores (por exemplo, condutividade, UV/VIS, detecção amperométrica ou hifenização com espectrômetros de massa), um alto grau de automação para máxima eficiência e baixo custo de propriedade (por exemplo, opções de preparação de amostra em linha ou calibração de padrão único) 

IC como uma abordagem validada para padrões USP-NF

Como um dos órgãos responsáveis pela padronização de métodos farmacêuticos, a USP-NF garante a qualidade, segurança e eficácia dos produtos farmacêuticos dentro do processo de fabricação e seu uso [6,7]. A história dos padrões USP-NF é bastante longa — mais de 200 anos [6]. No entanto, novos critérios de qualidade e tecnologias apoiaram uma iniciativa global de modernização da FDA (EUA). Administração de Alimentos e Medicamentos) e USP-NF em 2010.

CI, como uma abordagem metodológica para análise de impurezas vestigiais, excipientes, ingredientes farmacêuticos ativos (APIs), metabólitos e produtos de degradação e componentes iônicos em soluções farmacêuticas e fluidos corporais [5,8–15], tornou-se uma abordagem validada em vários capítulos da USP, ensaios, testes de impurezas e identificação. Aqui, o IC substituiu parcialmente os métodos tradicionais (por exemplo, titulação) ou foi incluído em novos padrões com foco no uso de métodos de última geração.

Os fundamentos das técnicas cromatográficas são apresentados nos Capítulos Gerais da USP <621> e <1065> [16,17]. Estes Capítulos Gerais descrevem detalhes sobre a metodologia e a configuração geral, bem como os principais parâmetros e requisitos para a precisão e confiabilidade dos métodos cromatográficos na análise farmacêutica. 

Capítulos Gerais da USP <621> e <1065>: Princípios básicos e fundamentos para cromatografia

O Capítulo Geral da USP <621> fornece uma visão geral de várias técnicas cromatográficas, juntamente com definições do aparelho e procedimento (por exemplo, fase móvel, coluna, tipos de eluição, procedimento do método), parâmetros comuns e requisitos para testes de adequação do sistema (por exemplo, repetibilidade do sistema, sensibilidade do sistema e desempenho de pico) [16]. A classificação das colunas cromatográficas também é explicada com uma lista de embalagens (números L), fases (G) e suportes (S), funcionando como referências para cromatógrafos [18].
 

Os números L para abordagens USP de cromatografia iônica e insights sobre o procedimento de equivalência de coluna são explicados no artigo abaixo.

Postagem do blog: Aplicação de métodos validados pela USP para equivalência de coluna de separação

Por outro lado, o Capítulo Geral da USP <1065> fornece uma visão geral abrangente do CI [16,17] e sua importância como um procedimento de teste reconhecido para identificar e quantificar analitos específicos (ensaios e impurezas). A cromatografia iônica é um procedimento de caracterização válido em muitas circunstâncias e está alinhada a todos os aspectos da produção farmacêutica [8,17]. Seu campo de aplicação é amplo, incluindo controle de qualidade de matérias-primas, substâncias medicamentosas ou produtos formulados, bem como para avaliação de águas de processo usadas para fabricação, meios de cultura, soluções de limpeza ou fluxos de águas residuais [17]. USP <1065> compreende conhecimentos básicos desta técnica: o que é cromatografia iônica, detalhes de instrumentação (Figura 1), mecanismos comuns de detecção, procedimentos e notas importantes para o desenvolvimento de métodos apropriados.

Explicações mais detalhadas dos critérios e requisitos para validação de métodos estão vinculadas ao Capítulo Geral <1225> Validação de Procedimentos Compendiais. Isso inclui testes de adequação do sistema para garantir que o sistema IC funcione corretamente antes da análise, avaliando parâmetros como resolução, tempo de retenção e formato de pico, bem como requisitos para validação com parâmetros-chave como linearidade, precisão, exatidão, especificidade, limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) [19]. Em geral, ao desenvolver um método de CI, é altamente importante selecionar fases móveis e estacionárias apropriadas (Figura 1) para garantir separação eficiente e seletividade e sensibilidade apropriadas (requisitos conforme USP <1225>) [17,19]. As fases móveis geralmente consistem em ácidos, bases ou sais diluídos dissolvidos em água de alta pureza, enquanto as fases estacionárias podem ser materiais à base de sílica ou de polímeros.

Pela sua importância, colunas e fases móveis apropriadas são inseridas nas monografias e Capítulos Gerais da USP. No entanto, a equivalência de colunas dá aos usuários alguma liberdade para implementar o método no fluxo de trabalho analítico. 

Saiba mais sobre colunas IC em nossa série de postagens de blog, começando aqui.

Postagem do blog: Boas práticas para colunas de separação em cromatografia iônica (IC) – Parte 1

Técnicas de detecção de IC e suas aplicações de acordo com USP <1065>

Quatro métodos de detecção de IC comumente usados são discutidos nesta seção (clique abaixo para pular para um tópico):

• detecção de condutividade
• Detecção UV/VIS
• detecção amperométrica
• IC hifenizado para espectrometria de massa

Detecção de condutividade

O método de detecção de IC mais comum é a condutividade [17]. O princípio – baseado na condutometria – é mostrado em Animação 3 [2]. A detecção de condutividade mede o quão bem os íons em uma solução conduzem corrente elétrica entre dois eletrodos, fornecendo informações sobre a concentração de espécies iônicas presentes. Quando combinado com um supressor, o sinal de fundo é reduzido e a sensibilidade e a relação sinal-ruído são significativamente aumentadas (Animação 2) [2,17].

O CI com detecção de condutividade tem uma ampla gama de aplicações para análise farmacêutica, incluindo:

A particularidade do IC reside na determinação de múltiplos analitos em uma única corrida, como mostrado, por exemplo, para múltiplos analitos aniônicos (acetato, cloreto, citrato e sulfato em uma solução de infusão; AN-N-051) ou para componentes catiônicos (sódio, potássio, cálcio e magnésio em fórmula de alimentação por gotejamento; AN-C-022). Graças às colunas IC de alta capacidade, a separação de analitos é possível mesmo nas matrizes mais fortes [7].

Detecção UV/VIS

UV/VIS – uma técnica de detecção óptica que pode ser usada diretamente, indiretamente, ou com derivatização pós-coluna – é útil para detectar íons que absorvem luz UV/VIS [2,17].

Detecção direta de UV-VIS é usado junto com a detecção de condutividade, por exemplo, para a determinação de íons que absorvem fortemente na faixa UV (nitrito, nitrato, ânions orgânicos) para melhorar sua detectabilidade na presença de altas concentrações de íons inorgânicos (cloreto, fosfato, sulfato) que não têm ou têm pouca capacidade de absorção de UV [2]. O princípio deste método de detecção é mostrado em Animação 4.

Para detecção indireta de UV, são utilizados eluentes com alta absorbância na região espectral visível ou ultravioleta (por exemplo, tampões de ftalato) [17]. O comprimento de onda de detecção é selecionado de modo que o eluente seja absorvido, mas os íons da amostra não. Essa escolha resulta em picos negativos que são proporcionais à concentração do analito.

Detecção amperométrica

A detecção amperométrica é um método analítico eletroquímico onde a corrente gerada pela oxidação ou redução de analitos em um eletrodo de trabalho é medida em função do tempo [20] (Animação 5). 

Um pré-requisito é que os íons alvo devem ser capazes de ser reduzidos ou oxidados, ou seja, substâncias eletroativas [2,17]. Exemplos de analitos são compostos orgânicos, metais de transição, ânions (por exemplo, nitrito, nitrato, sulfeto, sulfito) ou carboidratos [2]. Alguns exemplos de uso de CI com detecção amperométrica para a indústria farmacêutica incluem lactose (em produtos lácteos e suplementos, AN-P-089), catecolaminas (em uma solução farmacêutica injetável, AN-P-053), gentamicina (em solução de gentamicina, AN-P-080) e propilenoglicol (em solução tópica de diclofenaco, AN-P-076).

Nosso Livro Branco descreve a determinação de fosfato de polirribosilribitol (PRP) em um Haemophilus influenzae vacina usando IC com detecção amperométrica pulsada (Figura 4). 

A linha preta no cromatograma mostra um padrão com concentração de 3 µg/mL de PRP. A linha azul-esverdeada indica o conteúdo total de PRP (concentração final de 19,42 mg/L), dentro de 80–120% do valor declarado no rótulo (16–24 mg/L). De acordo com os critérios de qualidade, o PRP livre deve representar menos de 20% do conteúdo total de PRP. A amostra (linha verde-limão no cromatograma) mostra o teor de PRP livre determinado (concentração final de 2,03 mg/L) e atende aos requisitos.

IC hifenizado para espectrometria de massae

A cromatografia de íons pode ser hifenizada com espectrômetros de massa para aumentar a sensibilidade de detecção de ácidos orgânicos, carboidratos ou oligoelementos. A instrumentação inerte garante flexibilidade em relação à fase móvel utilizada e protege contra contaminação, o que é especialmente importante para a especiação de elementos traço. A técnica de supressão de IC garante que o líquido que entra nesses espectrômetros de massa altamente sensíveis contenha apenas analitos e água (e talvez alguns modificadores orgânicos). Isso é benéfico para condições de execução estáveis, sensibilidade de análise e extensão da vida útil do instrumento.
 

Saiba mais sobre a hifenização de IC com MS com nossos recursos aqui.

Hifenização de cromatografia iônica e espectrometria de massa

Livro Branco: Uma introdução à espectrometria de massa por cromatografia iônica (IC-MS)

Conclusão

A cromatografia iônica é uma ferramenta analítica poderosa e versátil para aplicações farmacêuticas. Ele é capaz de lidar com uma ampla variedade de tipos de amostras e oferece alta sensibilidade na detecção de substâncias iônicas e ionizáveis. A capacidade do IC de acoplar diferentes estratégias de detecção o torna inestimável na fabricação de produtos farmacêuticos e no controle de qualidade.

Suas conclusões de conhecimento

Monografias de medicamentos, ensaios e avaliações de impurezas – Atualize seus métodos de USP com a Cromatografia Iônica Metrohm

Folheto: Atualize seus métodos de USP!

Postagem do blog: Aplicação de métodos validados pela USP para equivalência de coluna de separação

Livro Branco: Quando o HPLC falha: IC em análises de alimentos, água e produtos farmacêuticos

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