Chromatografia jonowa dla przemysłu farmaceutycznego

Chromatografia jonowa (IC) jest techniką analityczną służącą do rozdzielania i oznaczania ilościowego substancji jonowych i polarnych. Technika IC cieszy się szeroką akceptacją przemysłu farmaceutycznego i organów regulacyjnych w szerokim zakresie aplikacyjnym, np. w ocenie jakości wody i analizie chemicznej. W ostatnich latach została dopuszczona do analizy produktów farmaceutycznych. Podczas prac aktualizacyjnych Farmakopea Stanów Zjednoczonych – US Pharmacopeia (USP), główna instytucja normalizacyjna zajmująca się produktami (bio)farmaceutycznymi, zauważyła i doceniła potencjał chromatografii jonowej, ustanawiając ją jako odpowiednią i ważną technikę w swoich dokumentach, analizach i, testach czystości.

W tym artykule pokrótce przedstawiono podstawy chromatografii jonowej, a następnie omówiono korzyści wynikające z jej zastosowania w analizie farmaceutycznej na podstawie USP General Chapter <1065> Ion Chromatography.

Kliknij, aby przejść bezpośrednio do tematu:

• Czym jest chromatografia jonowa? 
• Dlaczego chromatografia jonowa jest ważna dla przemysłu farmaceutycznego?
• Metody analiz chromatograficznych i ich zastosowania zgodnie z normą USP <1065>

Czym jest chromatografia jonowa?

Chromatografia jonowa (IC) to rodzaj wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) stosowany do jednoczesnego rozdzielania i oznaczania ilościowego analitów jonowych i polarnych, najczęściej z wykorzystaniem wymiany jonowej jako mechanizmu rozdzielania [1–3] (Animacja 1). 

Najczęściej wykorzystywane w chromatografii jonowej są kolumny separacyjne jonowymienne w połączeniu z detekcją konduktometryczną, ale powszechne jest również stosowanie innych technik detekcji, takich jak detekcja UV/VIS, detekcja amperometryczna lub techniki łączone, takie jak spektrometria mas [3,4]. Główne elementy zestawu do chromatografii cieczowej przedstawiono na rysunku 1. Należą do nich pompa wysokociśnieniowa z fazą ruchomą (eluentu), zawór iniekcyjny (wprowadzanie próbki), kolumna separacyjna (kolumna analityczna) oraz system detekcji (w tym derywatyzacja, akwizycja danych i przetwarzanie danych).

Dowiedz się więcej o rozwoju chromatografii jonowej w firmie Metrohm i licznych oferowanych przez Metrohm technikach detekcji przeglądając poniższe materiały.

Wpis na blogu: Historia Metrohm IC – Część 1

Monografia: Chromatografia jonowa

Monografia: Praktyczna chromatografia jonowa – wprowadzenie

Dlaczego chromatografia jonowa jest ważna dla przemysłu farmaceutycznego?

Mimo, że HPLC w przemyśle farmaceutycznym rozumiane jest głównie jako chromatografia cieczowa, chromatografia jonowa IC jest coraz częściej postrzegana jako niezależna metoda . Zalety IC w przemyśle farmaceutycznym w porównaniu z innymi metodami chromatografii cieczowej lub tradycyjnymi metodami, takimi jak miareczkowanie, można podsumować następująco [5,6]:

• analiza wielu analitów w jednym cyklu analitycznym
• dedykowana do analitów jonowych i polarnych
• tor analityczny pozbawiony metali  
• eluenty bazują na solach, słabych kwasach lub słabych zasadach
• supresja (Animacja 2) zapewnia niską linię bazową i niski stosunek sygnału do szumu, co poprawia czułość analityczną
• elastyczna aparatura: różne detektory (np. konduktometryczny, UV/VIS, detekcja amperometryczna lub połączona ze spektrometrią mas), wysoki stopień automatyzacji zapewniający maksymalną wydajność i niskie koszty użytkowania (np. opcje przygotowania próbek w trybie inline lub kalibracja przy użyciu pojedynczego standardu)

IC jako sprawdzone podejście do standardów USP-NF

Jako jeden z organów odpowiedzialnych za standaryzację metod farmaceutycznych, USP-NF zapewnia jakość, bezpieczeństwo i skuteczność produktów farmaceutycznych w procesie produkcyjnym i ich stosowaniu [6,7]. Historia norm USP-NF jest dość długa — ponad 200 lat [6]. Jednak nowe kryteria jakości i technologie wsparły w 2010 r. globalną inicjatywę modernizacyjną zarówno w FDA (USA) Agencja ds. Żywności i Leków), jak i USP-NF.

IC jako metoda analityczna do analizy śladowych zanieczyszczeń, substancji pomocniczych, aktywnych składników farmaceutycznych (API), metabolitów i produktów degradacji oraz składników jonowych w roztworach farmaceutycznych i płynach ustrojowych [5,8–15], stała się polecaną metodą  w licznych rozdziałach USP i  testach identyfikacyjnych. IC częściowo zastąpiła tradycyjne metody (np. miareczkowanie) lub została uwzględniona w normach skupiających się na stosowaniu najnowocześniejszych metod stosowanych w branży.

Podstawy technik chromatograficznych podano w rozdziałach ogólnych USP General Chapters <621> i <1065> [16,17]. Rozdziały ogólne opisują szczegółowo metodologię i ogólną konfigurację, a także kluczowe parametry i wymagania dotyczące dokładności i niezawodności metod chromatograficznych.

Rozdziały ogólne USP General Chapters <621> i <1065>: Podstawowe zasady i podstawy chromatografii

Rozdział ogólny USP General Chapter  <621> zawiera przegląd kilku technik chromatograficznych wraz z definicjami aparatury i procedury (np. fazy ruchomej, kolumny, typów elucji, procedury metody), wspólnych parametrów i wymagań dotyczących testowania przydatności systemu (np. powtarzalności systemu, czułości systemu i jego wydajności) [16]. Klasyfikację kolumn chromatograficznych objaśniono również za pomocą listy wypełnień (liczby L), faz (G) i nośników (S), stanowiących punkt odniesienia dla chromatografów [18].

W poniższym artykule wyjaśniono spojrzenie USP na liczbę L w chromatografii jonowej oraz podano informacje na temat procedury równoważności kolumn.

Wpis na blogu: Zastosowanie metod zatwierdzonych przez USP do oceny równoważności kolumn separacyjnych

Z drugiej strony rozdział ogólny USP General Chapter <1065> przedstawia kompleksowy przegląd IC [16,17] i jej znaczenie jako uznanej procedury testowej służącej do identyfikacji i ilościowego oznaczania konkretnych analitów (składników i zanieczyszczeń). Chromatografia jonowa jest ważną procedurą opisu natury substancji w różnych warunkach i jest zgodna ze wszystkimi aspektami produkcji farmaceutycznej [8,17]. Jej zakres zastosowań jest szeroki i obejmuje kontrolę jakości surowców, substancji leczniczych lub produktów gotowych, a także ocenę wód procesowych stosowanych w produkcji, pożywek hodowlanych, roztworów czyszczących lub strumieni ścieków [17]. USP <1065> obejmuje podstawową wiedzę na temat tej techniki: czym jest chromatografia jonowa, szczegóły dotyczące urządzeń (Rysunek 1), typowe mechanizmy oznaczania, procedury i ważne uwagi dotyczące odpowiedniego opracowywania metod.

Bardziej szczegółowe wyjaśnienia kryteriów i wymagań dotyczących walidacji metod znajdują się w rozdziale ogólnym General Chapter  <1225> Validation of Compendial Procedures. Obejmuje to testowanie przydatności systemu w celu zapewnienia, że system IC działa prawidłowo przed analizą, poprzez ocenę parametrów, takich jak rozdzielczość, czas retencji i kształt piku, a także wymagań dotyczących walidacji przy użyciu kluczowych parametrów, takich jak liniowość, dokładność, precyzja, swoistość, granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) [19]. Ogólnie rzecz biorąc, przy opracowywaniu metody IC niezwykle istotne jest dobranie odpowiednich faz ruchomych i stacjonarnych (Rysunek 1) w celu zapewnienia skutecznej separacji oraz odpowiedniej selektywności i czułości (wymagania zgodnie z USP <1225>) [17,19]. Fazy ruchome składają się zazwyczaj z rozcieńczonych kwasów, zasad lub soli rozpuszczonych w wodzie o wysokiej czystości, natomiast fazy stacjonarne mogą być wykonane z materiałów na bazie krzemionki lub polimerów.

Ze względu na ich znaczenie, kolumny i odpowiednie fazy ruchome zostały omówione w monografiach i General Chapters USP. Jednak równoważność kolumn daje użytkownikom systemów IC pewną swobodę ich implementacji w metodach analitycznych. 

Więcej informacji na temat kolumn IC znajdziesz w naszym cyklu wpisów na blogu, znajdującym się tutaj.

Wpis na blogu: Najlepsze praktyki dla kolumn separacyjnych w chromatografii jonowej (IC) – część 1

Metody jonowych analiz chromatograficznych i ich zastosowania zgodnie z normą USP <1065>

W tej sekcji omówiono cztery powszechnie stosowane metody oznaczania z użyciem chromatografii jonowej (kliknij poniżej, aby przejść do tematu):

• Detekcja konduktometryczna
• Detekcja UV/VIS
• Detekcja amperometryczne
• IC połączone ze spektrometrią mas

Detekcja konduktometryczna

Najczęściej stosowaną techniką detekcji w chromatografii jonowej jest detekcja konduktometryczna [17]. Zasada  tej metody przedstawiona jest w Animacji 3 [2]. Detekcja konduktometryczna wykorzystuje pomiar przewodnictwa elektrolitycznego roztworu znajdującego się pomiędzy dwiema elektrodami, dostarczając informacji o stężeniu obecnych w roztworze substancji jonowych. W połączeniu z supresorem następuje redukcja przewodnictwa tła (eluentu), a zwiększeniu ulega stosunek sygnału do szumu (Animacja 2) [2,17].

Chromatografia jonowa z detekcją konduktometryczną ma szeroki zakres zastosowań w analizie farmaceutycznej, obejmujący:

Szczególna cecha IC polega na oznaczaniu wielu analitów w jednym pomiarze, np. dla wielu analitów anionowych (octan, chlorek, cytrynian i siarczan w roztworze infuzyjnym; AN-N-051) lub dla składników kationowych (sód, potas, wapń i magnez w mieszankach do podawania kroplowego; AN-C-022). Dzięki kolumnom IC o dużej pojemności rozdzielanie analitów jest możliwe nawet w najtrudniejszych matrycach [7].

Detekcja UV/VIS

UV/VIS – spektrometryczna technika detekcji, którą można stosować bezpośrednio, pośrednio lub z reakcją zakolumnową – jest przydatna do wykrywania jonów absorbujących światło w zakresie UV/VIS [2,17].

Bezpośrednia detekcja UV/VIS jest stosowana także w połączeniu z detekcją konduktometryczną, np. do oznaczania jonów silnie absorbujących w zakresie UV (azotyny, azotany, aniony organiczne) w celu poprawy ich wykrywalności w obecności wysokich stężeń jonów nieorganicznych (chlorków, fosforanów, siarczanów), które nie mają zdolności pochłaniania promieniowania UV lub mają ją w niewielkim stopniu [2]. Zasada działania tej metody oznaczania przedstawiona jest na Animacji 4.

 Do pośredniej detekcji UV, stosuje się eluenty o wysokiej absorbancji w zakresie widzialnym lub ultrafiolecie (np. bufory ftalanowe) [17]. Długość fali detekcji dobierana jest tak, aby eluent, w przeciwieństwie do jonów próbki, wykazywał jak największą absorpcję. Wybór ten skutkuje powstawaniem pików ujemnych, które są proporcjonalne do stężenia analitu.

Detekcja amperometryczna

Detekcja amperometryczna to metoda analizy elektrochemicznej, w której mierzony jest prąd wytwarzany podczas utleniania lub redukcji analitów na elektrodzie roboczej [20] (Animacja 5). 

Warunkiem koniecznym jest, aby jony analitów ulegały redukcji lub utlenianiu, tj. były to substancje elektroaktywne [2,17]. Przykładami analitów są związki organiczne, metale przejściowe, aniony (np. azotyn, azotan, siarczek, siarczyn) lub węglowodany [2]. Niektóre przykłady zastosowania chromatografii jonowej z detekcją amperometryczną w przemyśle farmaceutycznym obejmują laktozę (w produktach mlecznych i suplementach, AN-P-089), katecholaminy (w roztworze do roztworów farmaceutycznych, AN-P-053), gentamycyna (w roztworze gentamycyny, AN-P-080) i glikol propylenowy (w roztworze diklofenaku, AN-P-076).

Nasza Biała Księga opisuje oznaczanie fosforanu polirybozylorybitolu (PRP) w Haemophilus influenzae - szczepionce, wykorzystujące układ IC z pulsacyjną detekcją amperometryczną (Rysunek 4).

Czarna linia na chromatogramie przedstawia standard o stężeniu 3 µg/ml PRP. Niebiesko-zielona linia oznacza całkowitą zawartość PRP (stężenie końcowe 19,42 mg/l) mieszczącą się w granicach 80–120% podanej na etykiecie zawartości (16–24 mg/l). Zgodnie z kryteriami jakościowymi, zawartość wolnego PRP nie może przekraczać 20% całkowitej zawartości PRP. Próbka (limonkowozielona linia na chromatogramie) przedstawia oznaczoną zawartość wolnego PRP (stężenie końcowe 2,03 mg/l) i mieści się w wymaganiach.

IC połączone z spektrometrem mas

Chromatografię jonową można połączyć ze spektrometrami mas w celu zwiększenia czułości wykrywania kwasów organicznych, węglowodanów lub pierwiastków śladowych. Wolny od metali, wykonany z inertnych materiałów tor analityczny systemów IC zapewnia elastyczność w zakresie stosowanej fazy ruchomej i chroni przed zanieczyszczeniami, co jest szczególnie ważne w przypadku oznaczeń specjacyjnych pierwiastków śladowych. Technika supresji IC zapewnia, że ciecz, która wpływa do tych niezwykle czułych spektrometrów, zawiera wyłącznie anality i wodę (oraz ewentualnie pewne modyfikatory organiczne). Jest to korzystne dla stabilnych warunków pracy, czułości analizy i wydłużenia żywotności instrumentu.

Dowiedz się więcej o łączeniu IC z MS tutaj:

Połączenie chromatografii jonowej i spektrometrii mas

Biała księga: Wprowadzenie do chromatografii jonowej ze spektrometrią mas (IC-MS)

Podsumowanie

Chromatografia jonowa jest potężnym i wszechstronnym narzędziem analitycznym w aplikacjach farmaceutycznych. Urządzenie jest w stanie obsługiwać szeroką gamę typów próbek i zapewnia wysoką czułość przy wykrywaniu substancji jonowych i polarnych. Możliwość łączenia różnych metod detekcji sprawia, że system IC jest nieoceniony w produkcji farmaceutycznej i kontroli jakości.

Dodatkowa wiedza (ang. wersje językowe)

Monografie leków, testy i oceny zanieczyszczeń – Uaktualnij swoje metody USP dzięki chromatografii jonowej Metrohm

Ulotka: Uaktualnij swoje metody USP!

Wpis na blogu: Zastosowanie metod zatwierdzonych przez USP do oceny równoważności kolumn rozdzielczych

Biała księga: Kiedy HPLC zawodzi: IC w analizie żywności, wody i produktów farmaceutycznych

Webinarium na żądanie: Od API do zanieczyszczeń i substancji pomocniczych – chromatografia jonowa do analizy farmaceutycznej

Webinarium na żądanie: Chromatografia jonowa do zastosowań farmaceutycznych

Webinarium na żądanie: Analiza zanieczyszczeń w produktach farmaceutycznych metodą chromatografii jonowej