İlaç endüstrisi için iyon kromatografi

İyon kromatografi (IC), iyonik ve polar analitleri ayırmak ve miktarını belirlemek için kullanılan analitik bir teknik olup, ilaç endüstrisi ve düzenleyici kurumlar tarafından su kalitesi ve kimyasal analiz için geniş bir uygulama yelpazesi sunabilmenin yanısıra, son yıllarda direkt ilaç analizleri için de geçerliliği artan bir yöntem haline gelmiştir. (Biyo)farmasötik ürünler için öncü standardizasyon kurumu olan Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi-Ulusal Formüller (USP-NF, US Pharmacopeia (USP)), modernizasyon yaklaşımları dahilinde IC'nin potansiyelini artırarak onu Genel Bölümler, tahliller ve safsızlık testlerinde uygun ve geçerli bir teknik olarak tanımlamaktadır.

Bu blog makalesinde, iyon kromatografinin temelleri kısaca tanıtılarak, USP Genel Bölüm <1065> İyon Kromatografi temelinde, farmasötik analizler için IC kullanımının avantajları ve uygulamaları anlatılmaktadır.

İhtiyacınız olan konu içeriğine doğrudan gitmek için aşağıda yer alan bağlantıları kullanın:

• İyon kromatografi nedir? 
• İyon kromatografi ilaç endüstrisi için neden önemlidir?
• USP <1065>'e göre IC tespit teknikleri ve uygulamaları

İyon kromatografi nedir?

İyon kromatografi, iyonik ve polar analitleri aynı anda ayırmak ve miktarını belirlemek için, çoğunlukla ayırma mekanizması olarak iyon değişimi kullanılan bir tür yüksek performanslı sıvı kromatografisidir (HPLC) [1–3] (Animasyon 1). 

İyon değiştirme ayırma kolonları ve iletkenlik tespitinin kombinasyonu, IC uygulamalarının çoğunu temsil etmektedir, ancak UV/VIS, amperometrik tespit veya kütle spektrometreleri gibi diğer tespit tekniklerinin kullanılması da yaygın olarak görülmektedir [3,4]. Bir sıvı kromatografi sisteminin ana bileşenleri Şekil 1'de gösterilmektedir. Bunlar arasında mobil faz (eluent), bir yüksek basınç pompası, enjeksiyon valfi (numune girişi), ayırma kolonu (analitik kolon) ve tespit sistemi (türevlendirme, veri toplama ve veri işleme dahil) bulunmaktadır. 

Metrohm'daki iyon kromatografi gelişimi ve birçok tespit tekniği hakkında daha fazla bilgi için aşağıdaki dokümanları inceleyebilirsiniz.

Blog makalesi: Metrohm IC'nin Tarihçesi – Bölüm 1

Monograf: İyon Kromatografi

Monograf: Uygulamalı İyon Kromatografi - Giriş

İyon kromatografi ilaç endüstrisi için neden önemlidir?

HPLC yaklaşımlarının ilaç endüstrisinde sıvı kromatografi yöntemlerine hakim olmasına rağmen, IC yöntemi de yaygın olarak kabul görmeye başlamıştır. IC'nin ilaç endüstrisi için diğer sıvı kromatografik veya titrasyon gibi geleneksel yöntemlere göre avantajları aşağıda özetlenmektedir [5,6]:

• tek bir analizde birden fazla analitin tespiti
• iyonik ve polar analitler için özel olması
• metal içermeyen akış yolu
• tuzlara, zayıf asitlere veya zayıf bazlara dayalı eluentleri
• düşük taban çizgisi ve düşük sinyal-gürültü oranı için baskılama (Animasyon 2), analitik hassasiyeti artırır
• esnek enstrümantasyon: çeşitli dedektörler (ör. iletkenlik, UV/VIS, amperometrik tespit veya kütle spektrometreleri ile eşleştirme), maksimum verimlilik ve düşük işletme maliyeti için ileri seviye otomasyon (ör. inline örnek hazırlama seçenekleri veya tek bir standarttan kalibrasyon)

USP-NF standartları için doğrulanmış bir yaklaşım olarak IC

Farmasötik yöntemlerin standardizasyonu için yönlendirici kurumlardan biri olan USP-NF, üretim sürecinde ve kullanımlarında farmasötiklerin kalitesini, güvenliğini ve etkinliğini sağlamaktadır [6,7]. USP-NF standartlarının 200 yılı aşan tarihçesi oldukça eskidir [6]. Ancak, yeni kalite kriterleri ve teknolojiler 2010 yılında FDA (ABD Gıda ve İlaç Dairesi) ve USP-NF'nin dünya çapındaki modernizasyon girişimini desteklemektedir.

IC, farmasötik çözeltilerdeki ve vücut sıvılarındaki eser safsızlıkların, yardımcı maddelerin, aktif farmasötik bileşenlerin (API'ler), metabolit ve bozunma ürünlerinin ve iyonik bileşenlerin analizi için metodolojik bir yaklaşım olarak [5,8-15], çok sayıda USP bölümünde, tahlillerde, safsızlık ve tanımlama testlerinde onaylanmış bir yaklaşım haline getirilmektedir. Bu kapsamda, IC kısmen geleneksel yöntemlerin (ör. titrasyon) yerini almakta veya endüstrideki en son yöntemleri kullanmaya odaklanan yeni standartlara dahil edilmektedir.

Kromatografik tekniklerin temelleri USP Genel Bölümleri <621> ve <1065>'de yer almaktadır [16,17]. Bu Genel Bölümler, farmasötik analizlerde kromatografik yöntemlerin doğruluğu ve güvenilirliği için temel parametreler ve gerekliliklerin yanı sıra, metodoloji ve genel kurulum hakkındaki ayrıntıları açıklamaktadır.

USP Genel Bölümleri <621> ve <1065>: Kromatografi için temel ilkeler ve esaslar

USP Genel Bölüm <621>, çeşitli kromatografik tekniklerin genel bir değerlendirmesinin yanı sıra cihaz ve yöntem tanımlamaları (ör. mobil faz, kolon, elüsyon türleri, yöntem prosedürü), ortak parametreler ve sistem uygunluk testi (ör. sistem tekrarlanabilirliği, sistem hassasiyeti ve pik performansı) için gereklilikleri içermektedir [16]. Ayrıca, kromatografik kolon sınıflandırması paketlemeleri (L-sayıları), fazları (G) ve destekleri (S) içeren bir liste ile açıklanmış olup, kromatografi uzmanları için referans oluşturmaktadır.  [18].
 

Aşağıdaki blog makalesinde, iyon kromatografik USP yaklaşımları için L-sayıları ve kolon eşdeğerlik prosedürü hakkında bilgiler açıklanmaktadır.

Blog makalesi: Ayırma kolonu eşdeğerliği için valide edilmiş USP metotlarının uygulanması

Öte yandan, USP Genel Bölüm <1065>, IC hakkında kapsamlı bir genel bakış [16,17] ve spesifik analitlerin (tahliller ve safsızlıklar) tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için onaylanmış bir test prosedürü olmasının önemini açıklamaktadır. İyon kromatografi birçok durum için geçerli bir karakterizasyon prosedürü olup, farmasötik üretimin tüm aşamalarıyla uyumludur [8,17]. Uygulama alanı hammaddelerin, ilaç maddelerinin veya formülasyonlu ürünlerin kalite kontrolünün yanı sıra üretim, besiyeri, temizlik çözeltileri veya atık su kaynaklarında kullanılan proses sularının değerlendirilmesini de içerecek şekilde oldukça geniştir [17]. USP <1065>, bu teknik hakkındaki temel bilgileri içermektedir: iyon kromatografinin ne olduğu, enstrümantasyon detayları (Şekil 1), yaygın tespit mekanizmaları, prosedürler ve uygun metot geliştirme için önemli notlar.

Metot validasyonuna yönelik kriterler ve gereklilikler hakkında daha kapsamlı açıklamalar, Genel Bölüm <1225> Kompendial Prosedürlerin Validasyonu ile bağlantılıdır. Bu, IC sisteminin analizden önce düzgün çalıştığından emin olmak için çözünürlük, tutunma zamanı ve pik şekli gibi parametrelerin yanı sıra lineerite, doğruluk, hassasiyet, özgüllük, tespit limiti (LOD) ve tayin limiti (LOQ) gibi önemli parametrelerle validasyon gerekliliklerini değerlendiren sistem uygunluk testini içermektedir [19]. Genellikle, bir IC yöntemi geliştirilirken, verimli bir ayrım ve uygun seçicilik ve hassasiyet sağlamak için doğru mobil ve sabit fazların (Şekil 1) seçilmesi son derece önemlidir (USP <1225> uyarınca gereklilikler) [17,19]. Mobil fazlar tipik olarak seyreltilmiş asitler, bazlar veya yüksek saflıktaki suda çözünmüş tuzlardan oluşurken, sabit fazlar ise silika bazlı veya polimer bazlı malzemelerden oluşabilmektedir.

Kolonlar ve uygun mobil fazlar, sahip oldukları önem nedeniyle USP'nin monograflarında ve Genel Bölümlerinde yer almaktadır. Fakat kolon eşdeğerliği, kullanıcılara analitik iş akışında yöntemin uygulanması için bir miktar esneklik sağlamaktadır. 

Buradan başlayarak, blog makale serimizden IC kolonları hakkında daha fazla bilgi edinebilirsiniz.

Blog makalesi: İyon Kromatografi (IC) ayırma kolonları için en iyi uygulamalar - Bölüm 1

USP <1065>'e göre IC tespit teknikleri ve uygulamaları

Bu bölümde, yaygın olarak kullanılan dört IC tespit yöntemi incelenmektedir (İhtiyacınız olan konu içeriğine doğrudan gitmek için aşağıda yer alan bağlantıları kullanın):

• i̇letkenli̇k tespi̇ti̇
• UV/VIS tespi̇t
• amperometrik tespit
• IC ve kütle spektrometresinin eşleştirilmesi

İletkenlik tespiti

En yaygın IC tespit yöntemi iletkenliktir [17]. İletkenlik ölçümüne dayanan çalışma prensibi, Animasyon 3'te gösterilmektedir [2]. İletkenlik tespiti, bir çözelti içindeki iyonların iki elektrot arasındaki elektrik akımını ne kadar iyi ilettiğini ölçerek mevcut iyonik türlerin konsantrasyonu hakkında bilgi vermektedir. Bir supressör ile birleştirildiğinde, arka plan sinyali azaltılmakta ve hassasiyet ile sinyal-gürültü oranı önemli ölçüde artırılmaktadır (Animasyon 2) [2,17].

IC ile iletkenlik tespiti, farmasötik analizler için geniş bir uygulama alanına sahiptir:

IC'nin en önemli özelliği, gösterildiği gibi tek bir çalışmada birden fazla anyonik analitin (bir infüzyon çözeltisindeki asetat, klorür, sitrat ve sülfat; AN-N-051) veya katyonik bileşenlerin (damardan verilen ilaç formülündeki sodyum, potasyum, kalsiyum ve magnezyum; AN-C-022) belirlenmesinde saklıdır. Yüksek kapasiteli IC kolonları sayesinde, en güçlü matrikslerde bile analitlerin ayrılması mümkündür [7].

UV/VIS tespit

UV/VIS, direkt, dolaylı veya kolon sonrası türevlendirme ile kullanılabilen bir optik algılama tekniğidir ve UV/VIS ışınını absorbe eden iyonları tespit etmek için kullanılmaktadır [2,17].

Direkt UV-VIS tespiti, UV absorpsiyon kabiliyeti olmayan veya çok az olan yüksek konsantrasyonlarda inorganik iyonların (klorür, fosfat, sülfat) varlığında, UV aralığında güçlü bir şekilde absorbe olan iyonların (nitrit, nitrat, organik anyonlar) tespit edilebilirliklerini artırmak için iletkenlik tespiti ile birlikte kullanılmaktadır [2]. Bu tespit yönteminin çalışma prensibi Animasyon 4'te gösterilmektedir.

Dolaylı UV tespiti için, görünür veya ultraviyole spektral bölgede yüksek absorbansa sahip eluentler (ör. ftalat tamponları)  kullanılmaktadır [17]. Dedeksiyon dalga boyu, eluentin absorbe edeceği ancak numune iyonlarının absorbe etmeyeceği şekilde seçilmektedir. Bu seçim, analit konsantrasyonu ile orantılı olan negatif pikler ile sonuçlanmaktadır.

Amperometrik tespit

Amperometrik tespit, bir çalışma elektrodunda analitlerin yükseltgenmesi veya indirgenmesiyle oluşan akımın, bir zaman fonksiyonu olarak ölçüldüğü elektrokimyasal bir analitik yöntemdir [20] (Animasyon 5). 

Ön koşul olarak, hedef iyonlarının ya indirgenebilir ya da yükseltgenebilir olması, yani elektroaktif madde olması gerekmektedir [2,17]. Örnek analitler organik bileşikler, geçiş metalleri, anyonlar (ör. nitrit, nitrat, sülfür, sülfit) veya karbonhidratlardır [2]. İlaç endüstrisi için IC ve amperometrik tespitinin kullanımının bazı örnekleri arasında laktoz (süt ürünleri ve takviyelerinde, AN-P-089), katekolaminler (farmasötik enjeksiyon çözeltisinde, AN-P-053), gentamisin (gentamisin çözeltisinde, AN-P-080) ve propilen glikol (diklofenak topikal çözeltisinde, AN-P-076) bulunmaktadır.

White Paper yayınında, Haemophilus influenzae aşısında poliribozilribitol fosfatın (PRP) IC ve puls amperometrik tespiti kullanılarak belirlenmesi açıklanmaktadır (Şekil 4).

Kromatogramda siyah çizgi 3 μg/mL PRP konsantrasyonuna sahip bir standardı göstermektedir. Mavi-yeşil çizgi, beyan edilen etiketin (16-24 mg/L) %80-120'si dahilindeki toplam PRP içeriğini (nihai konsantrasyon 19,42 mg/L) göstermektedir. Kalite kriterlerine göre, serbest PRP'nin toplam PRP içeriğinin %20'sinden az olması gerekmektedir. Numune (kromatogramdaki limon yeşili çizgi) belirlenen serbest PRP içeriğini (2,03 mg/L nihai konsantrasyon) göstermektedir ve gerekliliklere uymaktadır.

IC ve kütle spektrometresinin eşleştirilmesi

İyon kromatografi, organik asitler, karbonhidratlar veya eser elementlerin tespit hassasiyetini artırmak için, kütle spektrometreleri ile birlikte kullanılabilmektedir. İnert enstrümantasyon, kullanılan mobil faza yönelik esneklik sunmakta ve özellikle eser element türleme analizleri için önemli olan kontaminasyona karşı koruma sağlamaktadır. Baskılamalı IC tekniği, bu son derece hassas kütle spektrometrelerine giren sıvının yalnızca analit ve su (ve belki bazı organik değiştiriciler) içermesini sağlamaktadır. Bu, kararlı çalışma koşulları, analiz hassasiyeti ve cihazın kullanım ömrünün uzatılması için son derece faydalıdır.
 

IC'nin MS ile eşleştirilmesi hakkında daha fazla bilgi edinmek için aşağıda yer alan kaynakları inceleyebilirsiniz.

İyon Kromatografi ve kütle spektrometrelerinin eşleştirilmesi

White Paper: İyon kromatografi kütle spektrometrisine (IC-MS) giriş

Sonuç

İyon kromatografi, farmasötik uygulamalar için güçlü ve çok yönlü bir analitik araçtır. Çeşitli numune türlerini işleme kapasitesine sahiptir ve iyonik ve iyonize olabilen maddeleri tespit ederken yüksek hassasiyet sağlamaktadır. IC'nin farklı tespit stratejilerini birleştirme yeteneği, onu farmasötik üretimde ve kalite kontrolde paha biçilmez bir teknik haline getirmektedir.

Bilgi birikiminiz

İlaç monografları, analizleri ve safsızlık değerlendirmeleri – USP yöntemlerinizi Metrohm İyon Kromatografi ile güncelleyin

Broşür: USP yöntemlerinizi güncelleyin!

Blog makalesi: Ayırma kolonu eşdeğerliği için valide edilmiş USP metotlarının uygulanması

White Paper: HPLC başarısız olduğunda: gıda, su ve farmasötik analizde IC

İsteğe özel webinar: API'lerden safsızlıklara ve eksipiyanlara - Farmasötik analiz için iyon kromatografi

İsteğe özel webinar: Farmasötik uygulamalar için iyon kromatografi

İsteğe özel webinar: İyon Kromatografi ile farmasötik maddelerde safsızlıkların analizi