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L’industria medica è una nuova frontiera per la spettroscopia Raman. Negli ultimi anni, Raman è stato utilizzato negli studi dentistici e sul cancro e ora si sta basando su questo successo estendendolo alle applicazioni Point-of-Care (POC). Questo articolo offre una panoramica di alcune ricerche molto nuove ed entusiasmanti sull'uso della spettroscopia Raman per il rilevamento di tessuto canceroso, biomarcatori di malattie e agenti patogeni che causano malattie.

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Rilevazione di infezioni ossee con uno spettrometro Raman portatile

Le complicanze derivanti dall’infezione rappresentano un problema serio per l’uso di innesti ossei umani nella chirurgia muscolo-scheletrica. Lo Staphylococcus epidermidis e lo Staphylococcus aureus sono i colpevoli più comuni delle infezioni legate alle ossa e il trattamento di questi batteri è estremamente difficile.

Il rilevamento dei batteri stafilococco sul materiale dell’innesto e la distinzione tra osso sano e malato sono entrambi cruciali per prevenire l’infezione. La coltura di laboratorio richiede tradizionalmente 7-10 giorni per ottenere i risultati e comporta il rischio di contaminazione durante il trasporto e i test. Nei casi positivi il paziente deve essere trattato retroattivamente con dosi massicce di antibiotici. Una soluzione ideale per questa sfida è l'analisi in loco che consente all'équipe chirurgica di identificare ed evitare l'osso malato sul posto.

Recentemente, un gruppo di ricerca in Austria ha dimostrato con successo la differenziazione tra campioni di ossa sane e infette e tra due tipi di batteri stafilococchi utilizzando uno spettrometro Raman MIRA portatile [1]. La loro procedura ha analizzato le bande Raman delle impronte digitali di fosfati, ammidi e collageni e la loro diversa intensità e i rapporti di larghezza dei picchi per distinguere tra osso sano e malato. L'analisi delle componenti principali (PCA) ha supportato l'analisi ottica ed è stata utilizzata nella distinzione più precisa dei ceppi di stafilococco.

Il gruppo austriaco ha apprezzato il fatto che MIRA fosse «leggero, compatto e alimentato a batteria» e che la spettroscopia Raman avesse il vantaggio di «una preparazione minima del campione e risultati rapidi». Il test ha richiesto solo un minuscolo campione osseo per l’esame in situ durante l’intervento chirurgico e ha fornito risultati rapidi e accurati direttamente in sala operatoria.

Spettroscopia Raman per la rilevazione del cancro

Gli spettri dell’“impronta digitale molecolare” di Raman possono essere abbastanza sensibili da rilevare i cambiamenti chimici che accompagnano la malattia. Gli spettrometri Raman compatti possono aiutare i chirurghi a valutare i tumori durante le procedure chirurgiche per un processo decisionale più rapido. Esempi di applicazione per il cancro al seno e cancro al pancreas sono discussi di seguito.

Spettroscopia Raman tradizionale nella valutazione del cancro al seno

Quando si sospetta un cancro al seno, in genere è necessario un intervento chirurgico per la biopsia e un secondo per la rimozione dei tumori maligni. La capacità di valutare i tessuti sospetti durante l'intervento chirurgico preliminare consente la rimozione immediata, se necessario. Il vantaggio per il paziente e per l’industria medica è inestimabile e la ricerca suggerisce che la spettroscopia Raman potrebbe essere in grado di soddisfare questa esigenza per alcuni tipi di cancro.

 

La spettroscopia Raman è sufficientemente sensibile da rilevare i cambiamenti nei tessuti derivanti da molti tipi di cancro. Ad esempio, ci sono differenze molto sottili negli spettri Raman rispetto al tessuto mammario sano e ai tumori maligni. I ricercatori del Regno Unito hanno utilizzato un dispositivo da laboratorio i-Raman ad alta risoluzione (Figura 1) e strumenti multivariati, tra cui la PCA, per discriminare con successo i tessuti sani da quelli cancerosi [2].

Figura 1. i-Raman Prime 785S Spettrometro Raman portatile Metrohm

SERS per il rilevamento e la misurazione dei biomarcatori del cancro del pancreas

La SERS (spettroscopia Raman con miglioramento della superficie) può essere una soluzione quando Raman non è l'ideale per l'analisi. Questo potrebbe verificarsi in situazioni in cui il target esiste in una matrice di campione complessa o a causa della fluorescenza delle molecole a base di carbonio. Il SERS potenzia il segnale Raman, ma non il segnale di fluorescenza concorrente. Inoltre, l'effetto SERS consente il rilevamento sensibile degli analiti a livelli di mg/l, a volte fino a µg/l. Infine, i picchi SERS sono netti e ben definiti, consentendo un rilevamento e un'identificazione efficienti degli analiti target.

Per ulteriori informazioni su SERS, leggi il nostro precedente post sul blog su questo argomento.

Raman vs SERS… Qual è la differenza?

Il cancro al pancreas è mortale, in parte perché è difficile da diagnosticare. Tuttavia, esistono alcuni biomarcatori presenti a livelli elevati nel 75% circa dei casi positivi [3]. Questi possono essere rilevati con test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), che misurano una varietà di biomarcatori, inclusi anticorpi, antigeni e proteine.

In una tecnica emergente, uno spettrometro da laboratorio i-Raman è stato utilizzato presso l’Università dello Utah per l’analisi SERS insieme all’ELISA per rilevare un antigene associato al cancro del pancreas [2]. Il segnale SERS è stato generato da una molecola reporter complessata sia con una nanoparticella d'oro che con l'analita bersaglio in un dosaggio immunologico altrimenti classico a flusso laterale o «sandwich» (Figura 2). Si tratta di una tecnica incredibilmente accurata, che consente il rilevamento molto sensibile – con potenziale di quantificazione – del biomarcatore di interesse.

Figura 2. Il rilevamento di un antigene associato al cancro del pancreas è possibile con la spettroscopia Raman con miglioramento della superficie (SERS).

Test rapido Point-of-Care (POC) per il rilevamento a livello di femtogramma di COVID-19

Figura 3. MIRA XTR, spettrometro Raman palmare di Metrohm

Un formato ELISA alternativo è stato utilizzato dai ricercatori dell’Università del Wyoming per rilevare i biomarcatori antigenici associati all’infezione da COVID-19 [4]. Questo studio ha utilizzato un test supportato da nanoparticelle magnetiche per concentrare il biomarcatore target in soluzione per il successivo rilevamento SERS con MIRA XTR (Figura 3). Si è rivelato più sensibile dei test commerciali a flusso laterale, era compatibile sia con campioni di solvente che di saliva, poteva essere adattato a nuove varianti virali e ha ottenuto una diagnosi POC altamente sensibile di COVID-19.

I test immunologici a flusso laterale forniscono risultati relativamente rapidi, ma forniscono un rilevamento a livello di nanogrammi e presentano limitazioni di quantificazione. In confronto, l'ELISA basato su SERS è sensibile alle quantità di antigene del femtogramma, con risultati rapidi al POC con uno strumento Raman portatile commerciale.

Immunofenotipizzazione multiplex di cellule del sangue e del cancro al seno con spettroscopia Raman

Un altro studio ha utilizzato MIRA DS per valutare un sistema ELISA portatile basato su SERS per l’immunofenotipizzazione di diversi tipi di superfici cellulari del sangue e del cancro al seno [5]. La distinzione tra cellule sane e malate e il rilevamento di più biobersagli in un campione può supportare il trattamento informato di diversi tipi di cancro al seno.

Questo test aveva "specificità, sensibilità e ripetibilità per... immunofenotipizzazione in diversi tipi di cellule [utilizzando] un volume di campione di analisi più piccolo rispetto ai convenzionali... test immunologici multiplex," ed era meno "dispendioso in termini di lavoro e tecnicamente semplice da eseguire." Gli autori hanno elogiato Orbital Raster Scan di MIRA per aver migliorato la sensibilità del loro test attraverso un’area di interrogazione più ampia e misurazioni mediate spazialmente.

I tradizionali test di flusso in multiplexing possono essere limitati dalla disponibilità di coloranti colorati diversi e dall'interpretazione dei risultati. Sono anche associati a una grande impronta di laboratorio. Al contrario, questo metodo basato sulla spettroscopia Raman portatile offre il potenziale per risultati POC accurati con tempi rapidi dal campione al risultato, capacità di multiplexing e uno strumento molto compatto.

Facile rilevamento degli enzimi con l'effetto elettrochimico SERS

Figure 4. The SPELECRAMAN638 instrument from Metrohm performs spectroelectrochemical Raman measurements using a 638 nm laser.

Una tecnica SERS molto diversa per la caratterizzazione delle molecole biologiche è stata riportata da Metrohm [6]. Il SERS elettrochimico (EC-SERS) facilita due esperimenti contemporaneamente: attivazione elettrochimica delle caratteristiche SERS degli elettrodi d'argento (Ag SPE) seguita dal rilevamento spettroscopico del campione (con SPELECRAMAN638, Figura 4).

Qui, il substrato SERS viene generato in situ da elettrodi d'argento (serigrafati e convenzionali). Ciò viene ottenuto in presenza dell'analita durante l'interrogatorio continuo con Raman per ottimizzare il rilevamento delle specie attive SERS. L'eccitazione a 638 nm fornisce un effetto SERS di buona intensità, con meno rischi di danni al campione e fluorescenza.

Determinare la struttura degli enzimi (e il loro ruolo nelle malattie) come l’aldeide deidrogenasi (ALDH) aiuta a comprendere le malattie. Con EC-SERS, gli scienziati applicativi hanno definito bande Raman di ALDH precedentemente non riportate in soluzione. Allo stesso modo, gli stati redox del citocromo c forniscono informazioni sul trasporto degli elettroni attraverso le membrane cellulari [7]. Il citocromo c cambia lo stato di ossidazione e conformazione durante l'esperimento EC e questi stati redox possiedono spettri SERS distinguibili.

Conclusione

La tecnologia Raman viene realmente utilizzata in modi innovativi. Gruppi di ricerca in tutto il mondo stanno sfruttando i suoi considerevoli vantaggi – tra cui sensibilità, rilevamento di tracce, fattore di forma ridotto e risultati rapidi – per rilevare tessuti cancerosi, biomarcatori di malattie e agenti patogeni che causano malattie. I risultati sono incredibilmente entusiasmanti e promettenti!

[1] Lindtner, R. A.; Wurm, A.; Pirchner, E.; et al. Enhancing Bone Infection Diagnosis with Raman Handheld Spectroscopy: Pathogen Discrimination and Diagnostic Potential. IJMS 2023, 25 (1), 541. DOI:10.3390/ijms25010541

[2] Thomas, R.; Bakeev, K.; Claybourn, M.; Chimenti, R. The Use of Raman Spectroscopy in Cancer Diagnostics. Spectroscopy 2013, 28 (9), 36–43.

[3] Goonetilleke, K. S.; Siriwardena, A. K. Systematic Review of Carbohydrate Antigen (CA 19-9) as a Biochemical Marker in the Diagnosis of Pancreatic Cancer. Eur J Surg Oncol 2007, 33 (3), 266–270. DOI:10.1016/j.ejso.2006.10.004

[4] Antoine, D.; Mohammadi, M.; Vitt, M.; et al. Rapid, Point-of-Care ScFv-SERS Assay for Femtogram Level Detection of SARS-CoV-2. ACS Sens. 2022, 7 (3), 866–873. DOI:10.1021/acssensors.1c02664

[5] Wang, J.; Koo, K. M.; Trau, M. Tetraplex Immunophenotyping of Cell Surface Proteomes via Synthesized Plasmonic Nanotags and Portable Raman Spectroscopy. Anal. Chem. 2022, 94 (43), 14906–14916. DOI:10.1021/acs.analchem.2c02262

[6] Metrohm AG. Easy Detection of Enzymes with the Electrochemical-SERS Effect; AN-RA-008; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2023.

[7] Brazhe, N. A.; Evlyukhin, A. B.; Goodilin, E. A.; et al. Probing Cytochrome c in Living Mitochondria with Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. Sci Rep 2015, 5 (1), 13793. DOI:10.1038/srep13793

Ulteriori informazioni

Application Note: The Use of Raman Spectroscopy in the Field of Cancer Diagnostics

Application Note: Easy detection of enzymes with the electrochemical-SERS effect – Activation of enhanced features of silver electrodes helps obtain characteristic Raman bands of biological molecules

SERS trace detection solutions

Blog: Frequently Asked Questions (FAQ) about Raman spectroscopy: Theory and usage

Blog: Frequently Asked Questions (FAQ) about Raman spectroscopy: Applications

Blog: Handheld 785 nm Raman applications: Cutting edge material ID capabilities in your pocket

Blog: Raman spectroelectrochemistry from India to Spain: History and applications

Scattering Raman potenziato dalla superficie (SERS): espansione dei limiti dell'analisi Raman convenzionale

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Lo scattering Raman potenziato dalla superficie, o SERS, è un miglioramento anomalo dello scattering Raman quando le molecole vengono adsorbite su nanoparticelle di oro o argento: questo miglioramento può arrivare fino a 1e+7. Il vantaggio del SERS per il chimico analitico risiede nella sua capacità di rilevare concentrazioni di analiti di mg/L (ppm) e persino µg/L (ppb), mentre il Raman classico è limitato a g/L (ppt). Metrohm Raman produce test P-SERS sotto forma di nanoparticelle stampate su substrati utilizzando la tecnologia a getto d'inchiostro. Questo metodo produce strisce reattive poco costose che presentano stabilità e sensibilità eccezionali. Esistono due mercati che possono essere facilmente affrontati con P-SERS: analisi forense e sicurezza alimentare. Questo white paper spiega il meccanismo del SERS e come può essere applicato all'analisi Raman portatile con i sistemi Metrohm Raman MIRA.

Autore
Gelwicks

Dr. Melissa Gelwicks

Marketing Specialist
Metrohm Raman (a division of Metrohm Spectro), Laramie, Wyoming (USA)

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