4 giu 2025
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La scelta dell'eluente corretto in cromatografia è fondamentale, soprattutto per la cromatografia a scambio ionico (nota anche come cromatografia ionica o IC), così come la scelta della colonna corretta. Entrambi devono interagire in armonia per ottenere prestazioni di separazione ottimali. In cromatografia, spesso ci riferiamo al "triangolo della dipendenza", ovvero la relazione di interdipendenza tra analiti, fase stazionaria ed eluente. Questo articolo si concentra sulla parte eluente di questo triangolo, discutendo il ruolo degli eluenti (fasi mobili) nella IC, quali tipi di eluenti vengono utilizzati e cosa considerare nella scelta e nella preparazione di un eluente per la propria applicazione specifica.
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La Figura 1 illustra come questo concetto si applichi specificamente alla cromatografia ionica. Ciascuno dei tre componenti – analiti, fase stazionaria ed eluente – svolge un ruolo cruciale e interconnesso nel processo di separazione. La modifica di un componente influenza gli altri. Se l'equilibrio tra di essi viene alterato, ciò può influire negativamente sulla risoluzione dei picchi, sulla ritenzione degli analiti e sulle prestazioni complessive del metodo.
La comprensione di questo triangolo è essenziale per lo sviluppo di metodi di cromatografia ionica efficaci. Fornisce un quadro semplice per la risoluzione dei problemi e l'ottimizzazione della strategia di separazione per specifiche sfide analitiche. Conoscere le proprietà dell'eluente che possono influenzare la separazione degli analiti è fondamentale. Questo consente di sfruttare queste proprietà a proprio vantaggio e di ottenere le migliori prestazioni possibili nelle analisi di cromatografia liquida.
In cromatografia, l'eluente (fase mobile) è la soluzione liquida che trasporta gli analiti attraverso la colonna di separazione (fase stazionaria) (Figura 2). Prima di entrare nella pompa ad alta pressione, l'eluente viene degassato utilizzando un apposito degasatore. Quindi fluisce attraverso un iniettore (in figura, un iniettore 6/2) prima di essere pompato attraverso la colonna. Gli analiti vengono rilevati dopo il passaggio attraverso la colonna.
In cromatografia ionica, la soppressione viene utilizzata per eliminare le influenze conduttimetriche dell'eluente. Riduce al minimo il rumore di fondo, consentendo un rapporto segnale/rumore più elevato per i picchi risultanti. Questa fase di soppressione avviene tra la colonna e il rivelatore.
L'eluente svolge un ruolo cruciale nella separazione degli analiti in base alle loro interazioni con la colonna. In cromatografia ionica, l'eluente è solitamente a base di acidi, basi o sali. La composizione specifica dipende dalla carica dello ione da separare. Per l'analisi degli anioni, l'eluente è solitamente a base di miscele di carbonato di sodio/bicarbonato di sodio, idrossido di sodio o idrossido di potassio. Gli eluenti per l'analisi dei cationi sono solitamente a base di basse concentrazioni di acido nitrico, acido solforico o acido metansolfonico.
Come per tutte le separazioni mediante cromatografia liquida, la fase mobile IC è il parametro più semplice da modificare per influenzare la separazione degli analiti. Al contrario, la colonna e il sistema di rivelazione sono nella maggior parte dei casi predefiniti.
La scelta di un eluente idoneo può essere effettuata utilizzando un'ampia gamma di criteri. Tra gli altri, è necessario considerare i seguenti parametri: [1–8]:
Per preparare gli eluenti per la cromatografia ionica, è necessario utilizzare solo prodotti chimici di altissima qualità. La contaminazione da altri ioni avrà un effetto diretto sulla separazione dei picchi e sulla conducibilità misurata. Pertanto, l'utilizzo di reagenti di purezza inferiore influisce negativamente sulla quantificazione degli analiti target.
Inoltre, per la diluizione di queste sostanze chimiche, deve essere utilizzata solo acqua ultrapura (tipo 1).
Dopo la preparazione, gli eluenti freschi vengono spesso microfiltrati (0,2 µm) per rimuovere le particelle indesiderate. Queste possono accumularsi all'ingresso della colonna, riducendone quindi la durata. Inoltre, i sistemi IC possono essere dotati di filtri di aspirazione e in linea che contribuiscono a impedire l'ingresso di particelle nel flusso di eluente.
Il degasaggio dell'eluente è necessario, poiché le bolle d'aria influenzano direttamente il segnale di rilevamento. Questo può essere fatto degasando manualmente l'eluente sotto vuoto prima della misurazione oppure utilizzando un degasatore per eluente in linea nel percorso di flusso dello strumento. (Figura 2).
È necessario conservare correttamente gli eluenti per l'uso dopo la preparazione, l'accurata miscelazione e il degasaggio. Per gli eluenti che non reagiscono con l'anidride carbonica ambientale, le bottiglie vengono sigillate con tappi eluente e filtri antipolvere. Tuttavia, per gli eluenti alcalini con bassa capacità tampone che possono reagire con la CO2 presente nell'aria ambiente, è essenziale l'utilizzo di assorbitori di CO2 (vedi l'assorbitore collegato alla bottiglia dell'eluente nella Figura 2).
L'eluente non deve interferire con il metodo di rilevazione, ad esempio con un'elevata conduttività di base, un'elevata assorbanza UV alla stessa lunghezza d'onda dell'analita o una reazione con gli analiti di interesse. Ciò garantisce la migliore stabilità di base, riproducibilità dei tempi di ritenzione e sensibilità possibili. [4].
I prodotti chimici utilizzati per l'eluente non devono creare reazioni indesiderate con la fase stazionaria e devono essere chimicamente stabili per evitare interferenze o degradazioni durante l'analisi [5]. Pertanto, è necessario conoscere le proprietà della fase stazionaria. I produttori spesso descrivono le condizioni standard e i limiti della fase stazionaria, ad esempio l'intervallo di pH appropriato o l'aggiunta di modificatori organici.
Leggi il nostro articolo del blog correlato per saperne di più sulla scelta di una colonna IC e sull'ottimizzazione della separazione degli analiti.
Best practice per le colonne di separazione in cromatografia ionica (IC) – Parte 2
La composizione dell'eluente influenza direttamente la separazione degli ioni target, poiché ne influenza i tempi di ritenzione. I fattori più importanti da considerare sono elencati di seguito.
Nella IC, un aumento della concentrazione dell'eluente porta spesso a tempi di ritenzione più brevi e a una separazione più rapida. Tuttavia, ciò si traduce in una conduttività di fondo più elevata.
Per i picchi di analita sovraccarichi (elevata concentrazione di matrice), la ritenzione più debole degli ioni eluenti (concentrazioni più elevate di eluente) rispetto al picco di analita sovraccarico può portare a un accumulo di picchi (Figura 3), mentre una ritenzione più forte dello ione eluente (concentrazioni ridotte di eluente) può portare a un anticipo di picchi. (Figura 4).
Prendiamo come esempio il picco del cloruro nell'acqua di mare. Per il picco di fronteggiamento, il picco di sovraccarico del cloruro si sposta prima verso gli acidi organici e le tracce di ossoalogenuri prima del cloruro. Per il picco di coda, il picco di sovraccarico del cloruro si sposta più tardi verso nitriti e bromuri. [6].
Le alterazioni del pH dell’eluente portano a spostamenti nell’equilibrio di dissociazione dell’analita, modificando quindi il tempo di ritenzione dell’analita (Figura 5).
Il pH deve essere mantenuto entro un intervallo che impedisca la degradazione o l'alterazione della fase stazionaria, soprattutto per le colonne a base di silice, che sono sensibili a condizioni di pH estreme [7,9].
Inoltre, metodi di rilevamento come la conduttività e l'assorbimento UV sono sensibili alle variazioni di pH. Un pH fisso riduce al minimo il rumore di base e aumenta la sensibilità di rilevamento.[8].
La nostra raccomandazione per la separazione ionica è di isolare inizialmente gli ioni monovalenti, seguiti da quelli multivalenti. L'introduzione di ioni multivalenti tra ioni monovalenti, aumentando la concentrazione dell'eluente o modificandone il pH, comporta rischi significativi. Queste separazioni (e quindi la risoluzione dei picchi) sono particolarmente sensibili all'invecchiamento della colonna e alle variazioni da lotto a lotto.
I tamponi stabilizzano il pH di una soluzione. Un tampone appropriato garantisce risultati affidabili, accurati e riproducibili mantenendo un ambiente a pH stabile. Questo è particolarmente rilevante per analiti come acidi e basi. La loro carica dipende dalla costante di dissociazione acido/base, che è influenzata dal pH dell'eluente. [1].
Anche le costanti di dissociazione sono influenzate dalla temperatura. Pertanto, le variazioni di temperatura influenzano il tempo di ritenzione, soprattutto per acidi e basi. Un forno a colonna può stabilizzare le condizioni di temperatura e garantire misurazioni stabili.
Utilizzando eluenti carbonatici a temperature più elevate, si verifica un effetto a V in cui gli anioni monovalenti eluiscono prima e gli anioni multivalenti eluiscono dopo (Figura 6). Per gli eluenti idrossidi, questo effetto è noto come effetto a V inclinata dell'idrossido (Figura 7), poiché tutti gli ioni eluiscono più tardi, in particolare gli anioni multivalenti.
L'aggiunta di un solvente organico (ad esempio, metanolo, acetone o acetonitrile) a eluenti acquosi ha generalmente scarsa influenza sul tempo di ritenzione degli ioni non polarizzabili (ad esempio, fluoruro, cloruro, sodio, calcio, ecc.). Gli ioni polarizzabili e meno idrofili (ad esempio, ioduro, tiocianato, cationi organici di ammonio, ecc.) in genere eluiscono prima con l'uso di un modificatore organico.
Inoltre, i modificatori organici vengono spesso utilizzati per aumentare la ionizzazione all'interno della sorgente di ionizzazione elettrospray quando un cromatografo ionico è accoppiato a uno spettrometro di massa.
In cromatografia ionica, i tempi di ritenzione dei cationi possono essere modificati aggiungendo agenti complessanti all'eluente [3,11]. L'agente complessante funge da legante, mentre il catione analita funge da ione metallico centrale. Più un legante è selettivo rispetto a uno ione metallico centrale, maggiore è la sua influenza sul tempo di ritenzione. In scenari ideali, i tempi di ritenzione degli altri cationi subiranno solo una leggera variazione.
Gli agenti complessanti comunemente utilizzati includono crown ethers e acidi dicarbossilici come l'acido ossalico, l'acido dipicolinico e l'acido tartarico.
Gli agenti complessanti vengono utilizzati per ottenere una migliore separazione degli ioni dei metalli alcalini. L'aggiunta di 18-crown-6-ether (1,4,7,10,13,16-hexaoxacyclooctadecane) all'eluente consente una migliore separazione tra Na+, NH4+, e K+. Questa modifica è utile, ad esempio, per migliorare la determinazione del contenuto di tracce di NH4+ in campioni di acqua naturale con un elevato carico di K+.
La Figura 9 mostra come il tempo di ritenzione di K+ aumenti significativamente in seguito all'aggiunta di 18-crown-6-ether all'eluente (Tabella 1). Ciò può essere spiegato dalla formazione del complesso K+-18-crown-6-ether come mostrato in Figura 10, che è considerevolmente più grande. Il tempo di ritenzione del potassio aumenta a causa dell'ingombro sterico e, di conseguenza, della distanza da NH4+. Non si verificherà alcuna interferenza con l'ammonio anche ad alte concentrazioni di potassio.
| Peak | Component | RT [min] | RT [min] (18-crown-6) |
|---|---|---|---|
| 1 | Lithium | 4.31 | 4.25 |
| 2 | Sodium | 5.60 | 5.61 |
| 3 | Ammonium | 6.28 | 6.42 |
| 4 | Potassium | 8.46 | 10.39 |
| 5 | Calcium | 17.47 | 17.00 |
| 6 | Magnesium | 20.78 | 20.00 |
Gli acidi dicarbossilici formano complessi con molti cationi bivalenti. Tipicamente, questi complessi hanno una carica ridotta. Di conseguenza, quando si aggiungono acidi dicarbossilici all'eluente, i cationi multivalenti vengono trattenuti meno intensamente e vengono eluiti prima. L'entità di questa accelerazione è influenzata dalla costante di complessazione dello specifico complesso cationico.
La Figura 11 mostra questo effetto su magnesio, calcio e zinco quando si utilizza l'acido dipicolinico (noto anche come pyridine-2,6-dicarboxylic acid, PDC, or DPA) come modificatore dell'eluente. Rispetto al calcio o al magnesio, lo zinco, metallo di transizione, forma un complesso molto più forte con l'acido dipicolinico. Di conseguenza, è fortemente influenzato anche da basse concentrazioni di questo agente complessante. Lo zinco eluisce già prima del litio nel cromatogramma b), è totalmente complessato ed eluisce con il picco di iniezione in c). Il calcio è debolmente complessato con l'acido dipicolinico, ma il suo complesso è più forte che con il magnesio. La risoluzione di magnesio e calcio è ridotta nel cromatogramma b), mentre in c) il calcio eluisce già prima del magnesio. Questo modificatore viene applicato per ridurre il tempo di esecuzione delle determinazioni che analizzano calcio e magnesio oltre ai cationi dei metalli alcalini.
| Peak | Component | RT [min] (a) | RT [min] (b) | RT [min] (c) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Sodium | 6.79 | 6.50 | 5.39 |
| 2 | Potassium | 10.42 | 9.93 | 8.08 |
| 3 | Magnesium | 33.05 | 29.90 | 19.05 |
| 4 | Zinc | 38.24 | 3.38 | – |
| 5 | Calcium | 44.48 | 35.87 | 16.08 |
Dopo aver trovato l'eluente specifico che soddisfa le tue esigenze di separazione, puoi prendere in considerazione l'automazione. Esistono diversi modi per automatizzare la preparazione dell'eluente. Uno di questi è la preparazione di una soluzione concentrata di eluente da cui è possibile diluire facilmente e automaticamente l'esatta concentrazione di eluente. I concentrati sono disponibili presso Merck per tutti gli eluenti standard delle colonne Metrohm. Questi concentrati di eluente possono essere diluiti automaticamente, ad esempio con 941 Eluent Production Module.
Inoltre, per eluenti a base di idrossido come NaOH, KOH o LiOH, il 948 Continuous IC Module, CEP è la scelta ideale. Questo modulo può preparare elettroliticamente eluenti a base di idrossido utilizzando un concentrato di idrossido.
Gli eluenti sono un elemento chiave del triangolo di dipendenza in cromatografia ionica. Le corrette fasi di preparazione, i reagenti chimici utilizzati e molte altre variabili sono essenziali da considerare prima di preparare un eluente. La scelta e la preparazione appropriate dell'eluente sono cruciali per una misurazione cromatografica ionica affidabile e robusta.
Per ampliare le tue conoscenze sulla cromatografia ionica, scarica le nostre monografie qui sotto e inizia a lavorare con il tuo strumento IC.
[1] Kromidas, S. The HPLC Expert; Wiley-VCH: Weinheim, 2016.
[2] Haddad, P. R.; Jackson, P. E. Ion Chromatography; Journal of Chromatography Library; Elsevier: Amsterdam, 1990.
[3] Schäfer, H.; Läubli, M. Monograph: Ion Chromatography; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2023. https://www.metrohm.com/en/products/8/1085/81085077.html
[4] Liu, Y.; Kaiser, E.; Avdalovic, N. Determination of Trace-Level Anions in High-Purity Water Samples by Ion Chromatography with an Automated On-Line Eluent Generation System. Microchemical Journal 1999, 62 (1), 164–173. DOI:10.1006/mchj.1999.1699
[5] Zou, J.; Motomizu, S.; Fukutomi, H. Reversed-Phase Ion-Interaction Chromatography of Inorganic Anions with Tetraalkylammonium Ions and Divalent Organic Anions Using Indirect Photometric Detection. Analyst 1991, 116 (12), 1399–1405. DOI:10.1039/AN9911601399
[6] Wahab, M. F.; Anderson, J. K.; Abdelrady, M.; et al. A. Peak Distortion Effects in Analytical Ion Chromatography. Anal. Chem. 2014, 86 (1), 559–566. DOI:10.1021/ac402624a
[7] Martin, D. Column Chromatography; IntechOpen, 2013.
[8] Motomizu, S.; Oshima, M.; Hironaka, T. Ion-Exchange Chromatographic Determination of Anions by Indirect Photometric Detection: Comparison of Eluent Ions with Respect to Sensitivity Enhancement. Analyst 1991, 116 (7), 695–700. DOI:10.1039/AN9911600695
[9] Acikara, Ö. B. Ion-Exchange Chromatography and Its Applications. From the Edited Volume Column Chromatography, Edited by Dean F. Martin and Barbara B. Martin, InterOpen 2013. DOI:10.5772/55744
[10] Metrohm AG. Column Manual A Supp 19 (6.01034.4x0); 8.107.8013EN / 2023-03-08; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2023.
[11] Kolb, M.; Seubert, A.; Schäfer, H.; Läubli, M. (Editor). Monograph: Practical Ion Chromatography, 3rd ed.; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2020. https://www.metrohm.com/en/products/8/1085/81085069.html
Monografia: Cromatografia ionica pratica: un'introduzione
Monografia: Tecniche avanzate di rilevamento in cromatografia ionica
Brochure: 941 Eluent Production Module – Produzione di eluente in linea per cromatografia ionica
Manuale colonna: Metrosep A Supp 19
La seconda edizione, completamente rivista e aggiornata, della monografia "Cromatografia ionica" offre un'analisi approfondita della teoria e delle applicazioni pratiche della cromatografia ionica. Sono inoltre incluse discussioni dettagliate sulla teoria, sui metodi di rivelazione e sui tipi di colonne di separazione.
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