I microrganismi sono tra le forme di vita più diversificate sulla Terra. Presentano caratteristiche uniche e svolgono ruoli cruciali nei cicli ecologici dei nutrienti e dei materiali. I microrganismi sono essenziali per la produzione alimentare, inclusi yogurt e bevande alcoliche, e per la bonifica dei contaminanti ambientali. Inoltre, la modificazione genetica dei microrganismi facilita la produzione di prodotti preziosi come l'insulina. Data la loro importanza, molti paesi gestiscono depositi specializzati come l'American Type Culture Collection (ATCC) e la Swiss Collection of Microorganisms (SCM) per preservare e accumulare microrganismi.
Tradizionalmente, l'identificazione di microrganismi come i batteri implicava il sequenziamento del loro patrimonio genetico. Questo processo costoso richiede formazione e attrezzature specializzate. Tuttavia, la spettroscopia Raman è un potenziale strumento per l'identificazione dei batteri e la rilevazione dei metaboliti prodotti dalla coltura, fornendo informazioni sui bioprocessi e sulla funzione in un ecosistema. Il portfolio Raman da laboratorio di Metrohm include opzioni per l'interrogazione Raman a 785 nm e 1064 nm di colture batteriche.
La spettroscopia Raman è utilizzata in microbiologia per la sua potenzialità nell'identificazione dei batteri e nel monitoraggio dei metaboliti. Tutti gli organismi viventi sulla Terra sono composti da carbonio, idrogeno, ossigeno, azoto, fosforo, zolfo e altri oligoelementi. Questi elementi si legano tra loro per formare DNA, lipidi, amminoacidi e altre biomolecole. La composizione di queste biomolecole varia da organismo a organismo. Alcuni batteri immagazzinano metaboliti (ad esempio, polifosfati e glicogeno) a seconda delle condizioni ambientali. Gli spettri Raman dei batteri riflettono queste differenze chimiche, consentendone l'identificazione e chiarendone il ruolo nei bioprocessi.
Il terreno di coltura agarizzato in Lysogeny broth (LB) è stato preparato sciogliendo la polvere di LB e la polvere di agar in acqua deionizzata, seguendo le specifiche del produttore (Sigma-Aldrich). Dopo l'autoclavaggio, la miscela è stata versata in piastre Petri in vetro sterilizzate e raffreddata. Una volta solidificato l'agar LB, si sono premute le dita sulla superficie per trasferire i batteri al terreno. La piastra Petri è stata quindi incubata a temperatura ambiente fino all'osservazione di colonie batteriche.
La piastra di Petri è stata posizionata su un porta-sonda BAC150B e su un videomicroscopio BAC151C, e sono stati raccolti spettri Raman dalle colonie e dal terreno di coltura (Figura 1). La configurazione dello strumento e i parametri di acquisizione sono riassunti nella Tabella 1.
| Strumento | Probe holder (BAC150B) |
Video microscope (BAC151C) |
|---|---|---|
| i-Raman Prime 785 | BAC102-785HT | 50x objective |
| i-Raman EX | BAC102-1064HT | 50x objective |
| BWSpec Software | ||
| Acquisition Parameters* | ||
| Laser power (%) | 30–100 | |
| Integration time | 3–60 s | |
| Averages | 3–5 | |
Gli spettri Raman della colonia batterica (Figura 2) contenevano picchi rappresentativi di vari amminoacidi (1001, 1156 e 1654 cm⁻¹) e DNA (723, 669 e 1337 cm⁻¹). Queste caratteristiche, comunemente osservate nei batteri, confermano il successo di i-Raman Prime 785 nell'analisi microbica [1].
L'eccitazione Raman a 785 nm ha prodotto picchi più intensi e nitidi rispetto all'eccitazione a 1064 nm. Ciò è dovuto alla maggiore potenza di diffusione del laser a 785 nm e alla migliore risoluzione del rivelatore CCD al silicio rispetto al rivelatore a matrice InGaAs con una densità di pixel inferiore. Tuttavia, l'eccitazione a 1064 nm può attenuare la fluorescenza associata a substrati di colore scuro, come l'agar cioccolato o l'agar sangue.
Sull'agar LB si sono formati batteri con due morfologie distinte (bianca e gialla), suggerendo che si tratti di organismi diversi (Figura 3). Gli spettri Raman di questi due batteri erano notevolmente diversi, con i batteri gialli che mostravano picchi associati a pigmenti colorati comunemente presenti in piante e microrganismi. [1].
L'analisi delle componenti principali (PCA) può essere adatta per differenziare batteri con caratteristiche fenotipiche distinte in piccole comunità batteriche, come in questo esperimento (Figura 4). Tuttavia, i ricercatori in genere sviluppano algoritmi di apprendimento automatico per rilevare sottili differenze nei picchi minori, al fine di ottenere una caratterizzazione più dettagliata.
- Utilizzando piastre di Petri in vetro si evitano i contributi spettrali della plastica.
- Gli spettri Raman delle colonie possono cambiare dopo la conservazione a bassa temperatura e la coltura prolungata.
- Viene utilizzato un microscopio video con eccitazione laser a 1064 nm per visualizzare il punto laser
La spettroscopia Raman può essere utilizzata per acquisire spettri di colonie batteriche direttamente da terreni di coltura solidi. Gli spettri Raman acquisiti con eccitazione a 785 nm offrono una risoluzione più elevata, mentre l'eccitazione a 1064 nm riduce la fluorescenza dai terreni di coltura.
Le colonie batteriche semplici possono essere differenziate utilizzando modelli PCA, ma per caratterizzare comunità microbiche più complesse si possono utilizzare algoritmi avanzati di apprendimento automatico.
Gli utenti possono esportare facilmente i file spettrali dagli strumenti i-Raman per ulteriori analisi utilizzando il software BWSpec o altri strumenti di apprendimento automatico più avanzati.
- Paret, M. L.; Sharma, S. K.; Green, L. M.; et al. Biochemical Characterization of Gram-Positive and Gram-Negative Plant-Associated Bacteria with Micro-Raman Spectroscopy. Appl Spectrosc 2010, 64 (4), 433–441. DOI:10.1366/000370210791114293
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