Mikroorganismen gehören zu den vielfältigsten Lebensformen auf der Erde. Sie weisen einzigartige Eigenschaften auf und spielen eine entscheidende Rolle in ökologischen Nährstoff- und Stoffkreisläufen. Mikroorganismen sind für die Lebensmittelproduktion, einschließlich Joghurt und alkoholischer Getränke, sowie für die Beseitigung von Umweltschadstoffen von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus erleichtert die genetische Modifikation von Mikroorganismen die Produktion wertvoller Produkte wie Insulin. Aufgrund ihrer Bedeutung unterhalten viele Länder spezialisierte Aufbewahrungsorte wie die American Type Culture Collection (ATCC) und die Swiss Collection of Microorganisms (SCM), um Mikroorganismen zu konservieren und zu sammeln.
Traditionell war zur Identifizierung von Mikroorganismen wie Bakterien die Sequenzierung ihrer genetischen Zusammensetzung erforderlich. Dieser teure Prozess erfordert spezielle Schulungen und Ausrüstung. Die Raman-Spektroskopie ist jedoch ein potenzielles Instrument zur Identifizierung von Bakterien und zum Nachweis der von der Kultur produzierten Metaboliten und bietet Einblicke in die Bioprozesse und Funktionen in einem Ökosystem. Das Labor-Raman-Portfolio von Metrohm umfasst Optionen für die 785 nm- und 1064 nm-Raman-Abfrage von Bakterienkulturen.
Die Raman-Spektroskopie wird in der Mikrobiologie aufgrund ihres Potenzials zur Identifizierung von Bakterien und zur Überwachung von Metaboliten eingesetzt. Alle lebenden Organismen auf der Erde bestehen aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Phosphor, Schwefel und anderen Spurenelementen. Diese Elemente verbinden sich und bilden DNA, Lipide, Aminosäuren und andere Biomoleküle. Die Zusammensetzung dieser Biomoleküle variiert zwischen Organismen. Einige Bakterien speichern je nach Umweltbedingungen Metabolite (z. B. Polyphosphat und Glykogen). Die Raman-Spektren von Bakterien spiegeln diese chemischen Unterschiede wider, ermöglichen ihre Identifizierung und klären ihre Rolle in Bioprozessen auf.
Lysogenie-Brühe (LB)-Agar-Kulturmedium wurde durch Auflösen von LB-Pulver und Agar-Pulver in deionisiertem Wasser gemäß den Herstellerangaben (Sigma-Aldrich) hergestellt. Nach dem Autoklavieren wurde die Mischung in sterilisierte Petrischalen aus Glas gegossen und abgekühlt. Nachdem der LB-Agar erstarrt war, wurden die Bakterien mit den Fingern auf die Oberfläche gedrückt, um sie auf das Medium zu übertragen. Die Petrischale wurde dann bei Raumtemperatur inkubiert, bis Bakterienkolonien beobachtet wurden.
Die Petrischale wurde auf einen BAC150B-Sondenhalter und ein BAC151C-Videomikroskop gestellt und Raman-Spektren von Kolonien und dem Kulturmedium gesammelt (Abbildung 1). Die Geräteeinstellungen und Erfassungsparameter sind zusammengefasst in Tabelle 1.
| Instrument | Sondenhalter (BAC150B) |
Videomikroskop (BAC151C) |
|---|---|---|
| i-Raman Prime 785 | BAC102-785HT | 50x Objektiv |
| i-Raman EX | BAC102-1064HT | 50x Objektiv |
| BWSpec Software | ||
| Erfassungsparameter* | ||
| Laserleistung (%) | 30–100 | |
| Integrationszeit | 3–60 s | |
| Durchschnittswerte | 3–5 | |
Die Raman-Spektren der Bakterienkolonie (Abbildung 2) enthielten Peaks, die verschiedene Aminosäuren repräsentierten (1001, 1156 und 1654 cm-1) und DNA (723, 669 und 1337 cm−1). Diese bei Bakterien häufig beobachteten Merkmale bestätigen den Erfolg von i-Raman Prime 785 in der mikrobiellen Analyse [1].
Die Raman-Anregung bei 785 nm lieferte stärkere und schärfere Peaks als die Anregung bei 1064 nm. Dies ist auf die höhere Streuleistung des 785-nm-Lasers und die bessere Auflösung des Silizium-CCD-Detektors im Vergleich zum InGaAs-Array-Detektor mit geringerer Pixeldichte zurückzuführen. Eine Anregung mit 1064 nm kann jedoch die Fluoreszenz bei dunkel gefärbten Substraten wie Schokoladenagar oder Blutagar abschwächen.
Auf dem LB-Agar bildeten sich Bakterien mit zwei unterschiedlichen Morphologien (weiß und gelb), was darauf hindeutet, dass es sich um unterschiedliche Organismen handelt (Abbildung 3). Die Raman-Spektren dieser beiden Bakterien unterschieden sich deutlich. Die gelben Bakterien zeigten Peaks, die mit Farbpigmenten assoziiert werden, die häufig in Pflanzen und Mikroorganismen vorkommen [1].
Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) kann zur Unterscheidung von Bakterien mit unterschiedlichen phänotypischen Merkmalen in kleinen Bakteriengemeinschaften geeignet sein, wie in diesem Experiment (Abbildung 4). Allerdings entwickeln Forscher typischerweise Algorithmen für maschinelles Lernen, um subtile Unterschiede in kleineren Spitzen zu erkennen und so eine detailliertere Charakterisierung zu ermöglichen.
- Durch die Verwendung von Petrischalen aus Glas werden spektrale Beiträge von Kunststoff vermieden.
- Raman-Spektren von Kolonien können sich nach Lagerung bei niedrigen Temperaturen und längerer Kultivierung verändern.
- Ein Videomikroskop mit 1064 nm Laseranregung wird verwendet, um den Laserspot zu visualisieren
Mithilfe der Raman-Spektroskopie können Spektren von Bakterienkolonien direkt aus festen Kulturmedien gewonnen werden. Mit einer Anregung bei 785 nm erfasste Raman-Spektren bieten eine höhere Auflösung, während eine Anregung bei 1064 nm die Fluoreszenz des Kulturmediums reduziert.
Einfache Bakterienkolonien können mithilfe von PCA-Modellen differenziert werden, doch zur Charakterisierung komplexerer mikrobieller Gemeinschaften können fortschrittliche Algorithmen des maschinellen Lernens eingesetzt werden.
Benutzer können die Spektraldateien von i-Raman-Instrumenten problemlos zur weiteren Analyse mit der BWSpec-Software oder anderen fortschrittlicheren Tools für maschinelles Lernen exportieren.
- Paret, M. L.; Sharma, S. K.; Green, L. M.; et al. Biochemical Characterization of Gram-Positive and Gram-Negative Plant-Associated Bacteria with Micro-Raman Spectroscopy. Appl Spectrosc 2010, 64 (4), 433–441. DOI:10.1366/000370210791114293
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