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饮食是我们生活中至关重要的部分，关乎我们的身体健康。近些年来人们对于食品添加剂和膳食补充剂的兴趣增加，如低聚半乳糖等益生元开始引起人们的关注。食品和食品补充剂中低聚半乳糖的含量须满足标签和安全要求。目前对于低聚半乳糖的检测，应用非常广泛的是通过酶水解将其分解为小分子糖，然后进入色谱分析。本文对AOAC 2001.02 方法进行了改进，使用配有安培检测器的离子色谱（IC-PAD）对低聚半乳糖进行全自动分析。
什么是低聚半乳糖？
低聚半乳糖为在葡萄糖或半乳糖分子上链接1~7个半乳糖基的碳水化合物，是食品和饮料中少量天然存在的益生元。低聚半乳糖起初在人类母乳中发现，是母乳中的主要成分，其含量高达12g/L，因此被添加到婴幼儿奶粉中作为益生元补充剂。低聚半乳糖可以在肠道中表现出双岐化作用，可调节肠道菌群，支持非致病细菌的生长。
低聚半乳糖通常以粗料、浓缩粉末或糖浆的形式出现，一般被制造商用作添加剂或食品补充剂。
食品标签对低聚半乳糖的要求
环球益生元和低聚半乳糖市场的增长来自于消费者健康意识的提升，为回应这种意识提升，EU 1169/2011 和 EU 2015/2283 也对食品标签和安全要求做出了规定。因此我们须对食品和营养补充剂中的低聚半乳糖进行测定。
低聚半乳糖对人体健康影响的研究表明，每人每天摄入的低聚半乳糖建议不超过30g，婴幼儿配方奶粉则需要执行更加严格的规定。但是食品和营养补充剂中低聚半乳糖的含量却没有限制。
AOAC 2001.02
目前测量食品中低聚半乳糖非常常用的方法就是AOAC标准方法 2001.02。该方法是将低聚半乳糖从食品中提取出来之后将其水解为单糖，然后使用带有安培检测器的阴离子交换色谱进行分析。
在AOAC中，阴离子交换色谱被称之为高效阴离子交换色谱（HPAEC），这里我们简称为离子色谱（IC）。
AOAC 2001.02是将提取液与用酶（β-半乳糖苷酶）处理和水解的提取液进行比较。在β-半乳糖苷酶催化下，糖苷键断裂，低聚半乳糖和乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。 两种溶液中测定的游离半乳糖和乳糖的浓度差即可用来计算低聚半乳糖含量。（图1）
图 1. 根据 AOAC 2001.02 方法测定总低聚半乳糖含量的示意图，以及瑞士万通优化后的方法（绿色）。
对AOAC方法的改进
AOAC 2001.02 的样品制备过程相当复杂：一方面是对照提取液需要加入失活酶（相当昂贵）以维持提取液中初始碳水化合物浓度不变（图 1）。另一方面，样品稀释过程在乙腈中完成，而标准品是基于超纯水的。
本文中我们将简化整个过程以提高方法的易用性和分析效率。
实验证明，在提取溶液中添加失活酶与否并不会影响提取物中葡萄糖、半乳糖和乳糖浓度，因此我们取消了该步骤，节省了大量的费用和手工劳动。总低聚半乳糖含量的测定，仅需测量不含任何酶的提取液和添加了活性酶的水解液即可完成。
图 2. 某品牌益生元补充剂未处理（黑色）和酶处理（橙色）的叠加色谱图。
如果想要了解更多分析细节，您可以下载瑞士万通离子色谱法分析食品中总低聚半乳糖的应用报告AN-P-087。
Quality labels for novel foods – Improvement on AOAC 2001.02: GOS analysis with IC-PAD
除了酶的使用， AOAC 方法还建议在超纯水 (UPW) 中制备标准品，而用 20% 乙腈稀释实际样品。 我们按照以下条件做了对比试验：
- 使用纯水做校准曲线，纯水稀释样品（纯水）
- 使用纯水做校准曲线，乙腈稀释样品（AOAC方法）
- 使用乙腈做校准曲线，乙腈稀释样品（乙腈）
在以上三个条件中，低聚半乳糖含量的重现性在纯水和AOAC方法之间表现类似，而乙腈方法中低聚半乳糖含量低于其它方法，乙腈似乎对样品并不具有稳定作用。因此我们使用纯水对样品进行稀释来改进AOAC方法，减少化学试剂的使用。
结果
总体而言，改进后的方法在分离度、回收率以及特异性方面表现出很好的稳定性，半乳糖检出限为0.1mg/L，葡萄糖和乳糖为0.2mg/L，可以满足低浓度样品的测量需求。
总结
在糖类分析方面带有安培检测器的离子色谱法是一种灵敏、稳定且非常有选择性的多组分分析方法，无需任何额外的衍生步骤。 结合酶处理，离子色谱仪可以对非常复杂的糖类进行分析。
本研究对食品中低聚半乳糖测定的AOAC方法进行了优化，虽然原理相同，但是分析效率得到大幅提升，可以大大降低实验室时间和运行成本。如使用其它自动化样品处理技术，如英蓝逻辑稀释技术和英蓝自动校准技术，还可进一步提升工作效率。
想要了解更多使用离子色谱法测定食品中低聚半乳糖的简便方法，请参见我们发表在The Column from LC/GC (2021)上的文章：Improving on AOAC 2001.02: GOS Determination in Foods Using HPAEC–PAD。
