Bu blog makalesi iyon kromatografi kolonlarının doğru kullanımına ilişkin ipuçları ve püf noktaları sunan serinin üçüncü ve son yazısıdır. İlk bölümde, çoğunlukla standart çalışma koşulları ve kolonların çalışma limitleri tartışılmıştır; ikinci bölümde ise, uygulamayla ilgili konulara ve ayırma performansını değiştirmek için hangi elüsyon parametrelerinin değiştirilebileceğine odaklanılmıştır. Bu serinin son bölümünde, kolonun kullanım ömrü boyunca performansını değerlendirmenin yollarına daha yakından bakılacak ve ortaya çıkabilecek sorunların giderilmesine yardımcı olabilecek bazı sorun giderme ipuçları sunulacaktır. 

İhtiyacınız olan konu içeriğine doğrudan gitmek için aşağıda yer alan bağlantıları kullanın:

• Temel kolon parametreleri
• Tutunma zamanı ve kolon kapasitesi
• Teorik plaka sayısı ve pik simetrisi
• Kolon basıncı
• Kolon kullanım ömrünün sonu
• Sorun giderme adımlarına genel bakış

Temel kolon parametreleri

Kolon performansını değerlendirmek için, kullanılabilecek temel parametrelere bakılarak başlanmalıdır. Bu referans değerlerinin çoğu analiz sertifikasından elde edilmektedir.  Ayırma kolonu sertifikaları, Metrohm Sertifika Bulucu'dan indirilebilir. Kolon performansını doğrulamak için sertifika kromatogramının periyodik olarak tekrar edilmesi, kolon performansındaki değişikliklerin erken tespit edilmesine ve geri dönüşü olmayan hasarların önlenmesine yardımcı olmaktadır.

Metrohm Sertifika Bulucu

Aşağıda en önemli parametreler, tek tek ele alınmaktadır.

Tutunma zamanı ve kolon kapasitesi

Analitlerin her birinin tutunma zamanı, kolon seçiciliği ve kapasitesinin iyi bir ölçüsüdür. Analitlerin tutunma zamanları, sertifikadaki tutunma zamanları ile eşleşmediğinde, bu durumun birçok olası nedeni bulunmaktadır.

Muhtemelen, eluent bileşimi yanlıştır, ör. eluent bileşenleri doğru konsantrasyonlarda hazırlanmamış olabilir. Eluent kuvvetinin çok yüksek olması durumunda tutunma zamanları kısalmaktadır. Bu olay, genellikle tüm iyonlar için aynı anda meydana gelmekte ve tüm piklerin birbirine yaklaşmasına neden olmaktadır. Böylece, çok değerlikli iyonlar, tek değerlikli iyonlara göre daha güçlü bir şekilde hızlandırılmaktadır. Bu sorun, doğru bileşime sahip taze bir eluent hazırlanarak çözülebilmektedir.

Eluent taze olmayabilir veya örneğin bir CO₂ adsorblayıcı ile çevredeki atmosferden yeterince korunmamış olabilir. Ortamdaki karbondioksit, eluent bileşimini (ör. kuvvet, pH vb.) zamanla değiştirmekte ve bu da analitlerin tutunma zamanlarını etkilemektedir. Zayıf hidroksit elüentleri bu sorundan özellikle etkilenir, çünkü karbonat iyonlarının elüsyon kuvveti hidroksit iyonlarının elüsyon kuvvetinden çok daha güçlüdür ve bu da tutunma zamanlarında güçlü kaymalara yol açmaktadır. Bu nedenle, çok değerlikli iyonlar bu durumdan tek değerlikli iyonlara göre daha fazla etkilenmektedir. Bu sorun, yeni bir eluent hazırlanarak ve bir CO₂ adsorblayıcı kullanılarak çözülebilmektedir. Hidroksit eluentleriyle çalışırken, havadan CO₂'yi absorplayabildiği için hidroksit stok çözeltisinin de durumunu doğrulamak önemlidir. Şekil 1, ortamdan CO₂ alımının standart anyonların tutunma zamanları üzerindeki etkisini göstermektedir.

Bazı numuneler, kolon malzemesinin iyon değişim gruplarını tıkayabilecek bileşenler içerebilmektedir. Kolondaki mevcut iyon değişim gruplarının sayısı, başlangıç durumuna kıyasla azalır, bu durumda görünürde daha küçük bir kolon kapasitesine ve daha kısa tutunma zamanlarına yol açar. Kirletici maddelerin türüne bağlı olarak, bu etkiyi tersine çevirme ve bunları kolon yüzeyinden temizleme olasılıkları vardır. Bu rejenerasyon prosedürleri farklı sabit fazlara ayrı ayrı uyarlanmıştır ve bir kolonu kurtarmak için son seçenek olarak kullanılmalıdır.

Prosedürler ve çalışma limitleri kolonun ilgili broşürlerinde açıklanmakta ve internet sitemizede yer almaktadır. Rejenerasyon prosedürünü gerçekleştirmeden önce lütfen Metrohm yetkililerine danışınız.
 

Metrosep A Supp 17 kolon broşürü

• Kontaminasyonun çok değerlikli bir iyondan kaynaklanması durumunda, kolonun daha yüksek konsantrasyonlu bir eluent ile yıkanması ile bu kirlilikleri durulamak mümkündür. Bunu yaparken, kolonun çalışma limitlerini, özellikle de eluent pH'ını unutmayınız.
• Bazen organik moleküller, güçlü afiniteleri nedeniyle kolonun sabit fazına adsorbe edilebilmektedir. Bu, iyon değiştirme gruplarının tıkanmasına ve çalışma basıncının artmasıyla birlikte, tutunma zamanlarının azalmasına yol açabilmektedir. Bu gerçekleştiğinde, sabit fazın bir miktar organik çözücü içeren bir eluent ile yıkanması yardımcı olabilir. Bu, kirleticinin hareketli faza afinitesini artıracak ve onu sabit fazdan ayırmaya yardımcı olacaktır.

Genellikle böyle bir rejenerasyon prosedüründen sonra, kolonun orijinal kapasitesi geri kazanılabilmektedir.

Ayırma kolonunun ömrünü uzatmanın daha da iyi bir yolu da ön kolonu düzenli olarak değiştirmektir. Ön kolonun amaçlarından biri, kirletici maddeleri tutarak ayırma kolonunu korumaktır.

Ayırma kolonunun ömrü boyunca, ön kolonu üç ila dört kez, hatta boya veya gıda gibi çok karmaşık numune matrisleriyle çalışırken, daha sık değiştirdiğinizden emin olunuz. Bu gibi durumlarda, Metrosep RP 2 Guard/3.5 ön kolonunun kullanımı önerilmektedir.
 

Metrosep RP 2 Guard/3.5

Şekil 2'de üst üste çakıştırılan kromatogramlarda, kusurlu bir ön kolonunun pik şekli üzerindeki etkisi gösterilmektedir.

Bazı durumlarda, sabit fazın kimyasal modifikasyonu nedeniyle kolon kapasitesi azalmaktadır. Bu durum, bir kolonun çalışma limitleri dışındaki koşullarda (ör. aşırı pH durumları) kullanılması durumunda meydana gelmektedir. Aşırı pH koşulları, iyon değişim gruplarının temel parçacık substratına olan kimyasal bağlarını değiştirebilir. Geri dönüşü olmayan bu süreç, kalıcı kolon kapasitesi kaybına neden olur. Bu durumda hiçbir rejenerasyon prosedürü, orijinal kolon kapasitesini geri getiremez.

İyon değiştirme gruplarının kaybının, iyon değiştirme kolonlarının düzenli kullanımı sırasında da yavaş yavaş meydana geldiğini lütfen unutmayınız. İyon değiştirme gruplarının kimyasal bağlarının gücü, uzun kolon ömrü sağlamak amacıyla Metrohm kolonlarının geliştirilmesi sırasında kapsamlı bir şekilde test edilmektedir.

Teorik plaka sayısı ve pik simetrisi

Teorik plaka (TP) sayısı, kolonun dolgu durumunu değerlendirmek için yararlı bir araç olabilmektedir. TP değeri ne kadar yüksek olursa, kolonun paketlenmesi o kadar iyi olur. Kolon dolgu malzemesi hakkında anlamlı bir karara varmak için, kromatogramda çok erken elüsyona uğramayan (bu pikler, özellikle 2 mm'lik sistemlerde ekstra kolon tesirinden etkilenebilir) ve ikincil etkileşimlerden etkilenmeyen bir analit (ör. nitrat kullanmaktan kaçının) seçilmelidir. Katyonlar için potasyum, anyonlar için ise sülfat uygun bir seçimdir.

Kolonlar normal çalışma basıncından daha yüksek basınçlarda doldurulmasına rağmen, dolgu malzemesi, akan mobil fazın (eluent) sürekli uygulanmasıyla kolon ömrü boyunca daha da yoğunlaşmaya devam eder. Bu etki nedeniyle sabit fazın dolgu malzemesi iyileşirken, aynı zamanda ayırma kolonunun girişinde bir miktar ölü hacim oluşmasına da neden olabilir. Bu ölü hacim, özellikle kromatogramın başlangıcında, pikin genişlemesinden ve teorik plakaların azalmasından sorumlu olabilir.

Bu, kolonun düzenli bir yaşlanma süreci olsa da kolona iyi bakılarak bu durumu yavaşlatmak mümkündür. Önleyici eylemler arasında; eluent akış hızının yavaş başlatılması ve sistem başlatma sırasındaki sıcaklığının yanı sıra, dolgu malzemesine zarar verebilecek mekanik stres için kolonun sistemden çıkarılmasından önce yüksek basınç pompasının uygun ve tamamen kapatılması yer almaktadır. Ön kolonun değiştirilmesi, genellikle teorik plakalar ve pik şekilleri üzerinde olumlu bir etkiye sahip olabilir (bkz. Şekil 2).

Kolon dolgu malzemesi ile ilgili sorunlar, sıklıkla asimetri faktörü değerlerinde ve genel pik şekillerinde de görünür hale gelebilmektedir. Pik genişlemesinin yanı sıra, daha belirgin hale gelen pikin çıkış ayağı, kolonda veya ön kolonda bir yönlendirme için uyarı işaretleri olabilir. Ne yazık ki, kolonda meydana gelen bu tür bir hasarın geri dönüşü yoktur ve ayırma kolonunun değiştirilmesini gerektirir.

Kolon değişiminden önce, kromatogramda pik genişlemesi gözlemlendiğinde sorunların kolondan mı yoksa IC sistemindeki başka bir bağlantıdan mı kaynaklandığının kontrol edilmesi önemlidir. Yüksek basınç akış hattındaki tüm kapiler boruların çapının ≤0,25 mm olduğundan ve tüm kapiler boruların ek ölü hacim olmadan, doğru bir şekilde bağlandığından emin olunuz. Küçük iç çaplı (2 mm, microbore) kolonlarla donatılmış sistemler, 4 mm kolonlu olanlara göre ölü hacimden daha fazla etkilenmektedir. Bu, microbore kolonlar kullanıldığında pik genişleme etkisinin görünür hale gelmesi için 4 mm'lik kolonlara kıyasla daha az ölü hacmin gerektiği anlamına gelmektedir.

Kolon basıncı

Kolon ömrü boyunca düzenli olarak kontrol edilmesi gereken bir diğer önemli parametre ise sistem basıncıdır. Yüksek basınç, kolon değişimine yol açan en sık nedenler arasındadır. Basınç artışı fark edildiğinde, bunun IC sisteminin hangi kısmından kaynaklandığını doğrulamak önemlidir.

Numunenin partikül içermesi ve yetersiz numune hazırlama uygulanması durumunda, partiküller koruyucu ön kolonunun girişinde birikecek ve sonuçta sistem basıncının artmasına neden olacaktır. Bu durumda ön kolon, ayırma kolonunu koruma amacını yerine getirir ve değiştirilmesi gerekir. Ön kolon, yeterince kısa sürede değiştirilmezse, partikül kirliliği ön kolonu geçip ayırma kolonuna sızabilir ve burada bir yüklenme meydana gelebilir. Partikül yüklü bir ön kolon için herhangi bir rejenerasyon prosedürü bulunmamakla birlikte, partiküllerle kontamine olmuş ayırma kolonları, kolonun düşük akış hızlarında ters akış yönünde yıkanmasıyla rejenere edilebilir.

Lütfen bu rejenerasyon prosedürlerinin her zaman başarılı olamayacağını unutmayınız.

IC sisteminin yüksek basınçlı akış hattına partiküllerin enjekte edilmesinin önlenmesi, ön kolon ve ayırma kolonlarını korumanın iyi bir yoludur. Metrohm, kolonun ömrü üzerinde olumlu etki sağlayan çeşitli örnek hazırlama teknikleri sunmaktadır. Bu amaca yönelik en yaygın teknikler, Inline Ultrafiltrasyon (Şekil 3) ve Inline Diyaliz’dir.

Metrohm Inline Ultrafiltrasyon hakkında daha fazla bilgi edinmek için blog makalesini inceleyin.

Inline Ultrafiltrasyon’da membran filtrenin ne zaman değiştirilmesi gerekir?

Kolon kullanım ömrünün sonu

Yukarıda açıklanan parametrelerin tümü kolonun (ve IC sisteminin) performansını değerlendirmek için dikkate alınmalıdır. Bu parametrelerin birçoğu MagIC Net yazılımı üzerinden yakından izlenebilir, böylece olası bir sorun mümkün olduğunca erken olarak tespit edilebilir.

Metrohm IC kolonları çok uzun ömürlü olacak şekilde tasarlanıp üretilse de bir noktadan sonra performans düşecek ve rejenerasyon prosedürleri bile uygulama ihtiyaçlarını çözmek için gerekli kolon performansını geri getiremeyecektir. Bu da kolon ömrünün sonunu işaret eder ve ayırma kolonunun değiştirilmesini kaçınılmaz hale getirir.

Metrohm ayırma kolonları geri dönüşüme tabii değildir ve normal atıklarla birlikte bertaraf edilebilir. Ancak, ölçülen numunelerin yanı sıra kullanılan kimyasal türlerine ve bunlarla ilgili tehlikelere bağlı olarak, uygun bir bertaraf seçeneğinin değerlendirilmesi de gerekli olabilir.

Numunenin yapısına bakılmaksızın kolonu hiçbir zaman açmayınız.

Sorun giderme adımlarına genel bakış

Tablo 1 kolonunuzun performansına bakarken, belirli sorun giderme stratejilerine ilişkin bir genel bakış açısı sunmaktadır.

Sonuç

Bu blog makalesi, IC kolon performansının kolon ömrü boyunca nasıl değerlendirilip izlenebileceğini ve uzun kolon ömrünü sağlamak için ne gibi önlemlerin alınabileceğini açıklamaktadır. Bununla birlikte artık "İyon Kromatografi (IC) ayırma kolonları için en iyi uygulamalar" serisi tamamlanmaktadır. Daha fazla bilgi edinmek için yerel Metrohm IC satış temsilcinizle iletişime geçebilirsiniz.

Bilgi birikiminiz

IC Kolonları için ipuçları ve püf noktalar