Поделиться статьей
В третьей статье вы найдете советы и рекомендации по правильному использованию колонок для ионной хроматографии. В первой части мы обсуждали стандартные условия работы, а также эксплуатационные ограничения для колонок. Во второй части мы сосредоточились на темах, связанных с применением, какие параметры элюирования можно изменить для повышения эффективности разделения. Сейчас мы более подробно рассмотрим способы оценки производительности колонки на протяжении всего срока эксплуатации и поделимся советами по устранению неполадок и возможных проблем.
Ниже вы можете перейти сразу к темам:
Основные параметры колонки
Начнем с рассмотрения основных параметров, по которым можно сделать вывод о производительности вашей колонки. Большинство эталонных значений можно найти в сертификатах анализа. Они доступны онлайн в поиске Metrohm Certificate Finder на нашем сайте. Периодическое воспроизведение хроматограммы сертификата для проверки производительности колонки полезно для раннего обнаружения изменений в производительности и предотвращения необратимого повреждения колонки.
Далее по порядку рассмотрим самые важные параметры.
Время удерживания и емкость колонки
Время удерживания отдельных аналитов является хорошей мерой селективности и емкости колонки. Если время удерживания аналитов не совпадает с эталонными значениями на сертификате, на это есть ряд возможных причин.
Возможно, состав элюента ошибочный, и компоненты элюента присутствуют в неправильных концентрациях. При слишком высокой концентрации элюента время удерживания уменьшается. Это явление обычно происходит для всех ионов одновременно и сближает все пики. Многовалентные ионы ускоряются в большей степени, чем одновалентные ионы. Проблема решается приготовлениемв свежего элюента с правильным составом.
Элюент может быть устаревшим или недостаточно защищенным от окружающей атмосферы (например, CO2). Углекислый газ из окружающего воздуха со временем изменяет состав элюента (концентрацию, рН и т. д.) и влияет на время удерживания аналитов. Проблема особенно актуальна для слабых гидроксидных элюентов, поскольку сила элюирования карбонат-ионов намного выше, чем у гидроксид-ионов, что приводит к сильным сдвигам во времени удерживания. Поэтому многовалентные ионы больше подвержены этому фактору, чем одновалентные. Проблему можно решить, приготовив свежий элюент и используя поглотитель CO2. При работе с гидроксидными элюентами также важно проверять состояние исходного раствора гидроксида, поскольку он может поглощать CO2 из воздуха. На Рис. 1 показано влияние CO2 из воздуха на время удерживания обычных анионов.
Некоторые образцы могут содержать компоненты, занимающие ионообменные группы материала колонки. В этом случае количество доступных ионообменных групп на колонке уменьшается, что приводит к уменьшению и емкости колонки, и сокращению времени удерживания. В зависимости от типа загрязнителя этот эффект можно обратить и смыть их с поверхности колонки. Подобные методы регенерации адаптируются индивидуально к различным неподвижным фазам и должны использоваться в случае крайней необходимости.
Сами методы, а также рабочие ограничения описаны в соответствующих брошюрах колонки, которые вы найдете на нашем сайте. Перед выполнением регенерации проконсультируйтесь с нашими специалистами Metrohm.
Leaflet for Metrosep A Supp 17
- В случае загрязнения многовалентным ионом промойте колонку элюентом более высокой концентрации. При этом не забывайте про рабочин диапазоны колонки, особенно в отношении pH элюента.
- Иногда органические молекулы из-за сильного сродства могут адсорбироваться на неподвижной фазе колонки. Это приведет к блокировке ионообменных групп и сокращению времени удерживания при повышении рабочего давления. В этом случае может помочь промывка неподвижной фазы элюентом, содержащим фракцию органического модификатора. Это повысит сродство загрязнителя к подвижной фазе и отделит его от неподвижной.
Обычно после регенерации удается восстановить первоначальную емкость колонки.
Но мы рекомендуем способ еще лучше — регулярная замена предколонки. Цель предколонки — защищать разделительную колонку от загрязняющих веществ (задерживать их).
Обязательно меняйте предколонку три-четыре раза в течение всего срока эксплуатации разделительной колонки. При работе с очень сложными образцами (красители или пищевые продукты) рекомендуем делать это еще чаще. В таких ситуациях мы предлагаем использовать Metrosep RP 2 Guard/3.5.
Хроматограмма на Рис. 2 показывает как влияет неисправная предколонка на форму пика.
В некоторых случаях производительность колонки снижается из-за химической модификации неподвижной фазы, когда колонка используется в условиях, выходящих за пределы рабочих диапазонов. Например, экстремальные условия pH могут изменить химические связи ионообменных групп с субстратом основной частицы. Этот необратимый процесс приводит к неисправимой потере емкости колонки. В этом случае никакая процедура регенерации не может восстановить первоначальную емкость.
Обратите внимание, что потеря ионообменных групп происходит и при регулярном использовании колонок, но она очень медленная. Прочность химической связи ионообменных групп тщательно проверяется при разработке, чтобы обеспечить длительный срок службы колонок Metrohm.
Теоретическая тарелка и симметрия пика
Число теоретических тарелок (TТ) — полезный показатель для оценки состояния набивки колонки. Чем выше значение ТТ, тем лучше заполнение. Для достоверной оценки выберите аналит, который не слишком рано элюируется на хроматограмме (на эти пики могут влиять внеколоночные факторы, особенно в 2-мм системах) и на который не влияют вторичные взаимодействия (т. е. избегайте использования нитратов). Для катионов хорошим выбором является калий, а для анионов — сульфат.
Несмотря на то, что колонки заполнены при давлении выше нормального рабочего давления, набивка продолжает уплотняться в течение всего срока службы колонки при непрерывном применении проточной подвижной фазы (элюента). В то время как набивка неподвижной фазы улучшается, это также может привести к мертвому объему на входе в колонку. Мертвый объем может быть причиной размывания пиков и уменьшения теоретических тарелок, особенно в начале хроматограммы.
Это обычный процесс "старения" колонки, но его можно замедлить, если проявить немного заботы. Профилактика включает медленное увеличение расхода и температуры элюента при запуске, а также надлежащее и полное отключение насоса высокого давления перед снятием колонки, поскольку механическое напряжение может повредить набивке. Замена предколонки оказывает положительный эффект на теоретические тарелки и формы пиков (см. Рис. 2).
Проблемы с набивкой также часто проявляются в значениях коэффициента асимметрии и в общих формах пиков. Более выраженное расширение переднего фронта, а также размывание пика могут предупреждать об образовании каналов в колонке или предколонке. К сожалению, такое повреждение колонки является необратимым и требует ее замены.
Перед заменой важно проверить, не связаны ли проблемы с колонкой или другим соединением в системе всякий раз, когда на хроматограмме наблюдается размывание пика. Убедитесь, что все капилляры на пути высокого давления имеют диаметр ≤0,25 мм и что все капилляры установлены и подключены правильно без дополнительного мертвого объема. Системы с колонками малого внутреннего диаметра (2 мм, микроотверстие) сильнее подвержены мертвому объему, чем системы с 4 мм. Это означает, что при использовании колонок с микропорами требуется меньший мертвый объем, чтобы эффект расширения пиков стал видимым, по сравнению с колонками диаметром 4 мм.
Давление в колонке
Еще одним важным параметром, который необходимо регулярно проверять, является давление в системе. Высокое давление является одной из самых частых причин, приводящих к замене колонки. Каждый раз, когда вы обнаруживаете повышение давления, проверьте какая часть системы является тому причиной.
Если образец содержит частицы и недостаточно фильтруется перед анализом, частицы будут скапливаться на входе в защитную предколонку и в конечном итоге приведут к повышению давления в системе. В этом случае предколонка выполнит свое предназначение и потребует замены. Но если предколонку оперативно не заменить, частицы могут прорваться и попасть на разделительную колонку. Для предколонки не существует процедуры регенерации, но зягрязненные разделительные колонки можно регенерировать путем промывки колонки при низких скоростях в обратном направлении потока.
Обратите внимание, что методы регенерации не всегда могут быть успешными.
Предотвращение попадания частиц в канал высокого давления является хорошим способом защиты предколонок и разделительных колонок. Metrohm предлагает несколько автоматизированных методов пробоподготовки, которые положительно влияют на срок службы устройств. Самые распространенные из них — Инлайн Ультрафильтрация (Рис. 3) и Инлайн Диализ.
Почитать про метод инлайн ультрафильтрации Metrohm можно в нашем блоге.
When do I have to exchange the filtration membrane with Inline Ultrafiltration?
Окончание эксплуатации колонки
Все параметры, описанные выше, следует учитывать для оценки производительности колонки (и всей ИХ системы). Многие из них можно отслеживать в программном обеспечении MagIC Net и выявлять потенциальную проблему как можно раньше.
Колонки Metrohm разработаны с расчетом на очень длительный срок службы, но по причинам выше, производительность может снизиться, и даже процедуры регенерации будут не в состоянии восстановить требуемую производительность для выполнения задач. Этот рубеж и станет окончанием срока службы колонки, и неизбежно придется искать замену.
Разделительные колонки Metrohm не подлежат вторичной переработке, их можно утилизировать с обычными отходами. Но в зависимости от образцов и фактора опасности химических веществ, рассмотрите вариант надлежащей утилизации.
Независимо от природы вашего образца, никогда не вскрывайте колонку.
Поиск неисправностей
В Табл. 1 представлен обзор некоторых стратегий устранения неполадок при анализе производительности вашей колонки.
Таблица 1. Предотвращение и устранение потери производительности в ионнохроматографических колонках
| Индикатор | Причина | Профилактические и исправительные меры |
|---|---|---|
| Увеличение противодавления | Частицы на предколонке | Замените предколонку |
| Частицы на разделительной колонке | Промойте колонку в обратном направлении потока
|
|
| Частицы в образце | Подготовка образца, например, удаление частиц с помощью инлайн ультрафильтрации | |
| Сокращенное время удержания | Карбонат в элюенте | Углекислый газ из воздуха влияет на баланс карбоната/гидрокарбоната в элюенте. Элюент карбонат/гидрокарбонат со временем ослабевает; гидроксидный элюент укрепляется.
|
| Пузырьки воздуха в элюенте | Пузырьки воздуха дестабилизируют поток элюента. Противодавление является индикатором нестабильного потока. Оно должно оставаться стабильным в диапазоне ± 0,1 МПа.
|
|
| Потеря емкости в колонке из-за высоковалентных ионов | Регенерируйте колонку в соответствии с инструкцией, чтобы удалить любые минеральные отложения |
|
| Потеря разрешающей способности | Элюент слишком старый или приготовлен неправильно | Элюенты должны быть свежеприготовлены. Убедитесь, что они произведены правильно и, в частности, что карбонат и гидрокарбонат не перепутаны |
| Адсорбционный эффект загрязнения в предколонке | Замените предколонку | |
| Адсорбционный эффект загрязнения в разделительной колонке | Регенерируйте колонку в соответствии с инструкцией, чтобы удалить любые органические или неорганические отложения |
|
| Потеря теоретических тарелок | Загрязнена предколонка | Замените предколонку |
| Разделительная колонка загрязнена | Регенерируйте колонку в соответствии с инструкцией, чтобы удалить любые органические или неорганические отложения | |
| Разделительная колонка перегружена | Разделительная колонка может быть перегружена фактора высокого содержания соли в матрице образца
|
|
| Мертвый объем в системе ионной хроматографии |
|
|
| Ассиметрия | Мертвый объем или загрязнение на предколонке | Замените предколонку |
| Разделительная колонка загрязнена | Регенерируйте колонку в соответствии с инструкцией, чтобы удалить любые органические или неорганические отложения |
Заключение
В этой статье объясняется, как можно оценивать и контролировать производительность вашей колонки, какие меры можно предпринять для обеспечения длительного срока службы колонки. На этом мы завершаем серию статей «Рекомендации по работе с разделительными колонками в ионной хроматографии (ИХ)». Если у вас есть дополнительные вопросы, не стесняйтесь обращаться к нашим специалистам по хроматографии Metrohm.
