Menerapkan metode tervalidasi USP untuk kesetaraan kolom pemisahan

The United States Pharmacopeia (USP) mulai memperbarui sekitar 4300 Monograf dan 220 Bab Umum dengan teknologi modern pada tahun 2010 [1]. Pada masa ini, kromatografi ion (IC) juga menjadi teknik analisis yang lebih populer seiring dengan semakin matangnya teknologi. Badan pengatur sekarang menganggap IC sebagai teknologi yang dapat diterima untuk menganalisis obat-obatan dan biofarmasi.

Cakupan analisis IC dalam industri farmasi cukup luas. IC dapat menilai jejak pengotor, eksipien, bahan aktif farmasi (API), dan metabolit, serta menentukan komponen ionik dalam larutan farmasi dan cairan tubuh [2-10]. Parameter kendali mutu ini dapat diukur pada bahan mentah, selama proses produksi, dan pada produk akhir. IC juga cocok untuk pengendalian kualitas air proses dan air limbah – menjaga produksi dan memastikan bahwa air limbah yang dibuang memenuhi peraturan [2,11–17].

Artikel blog ini berfokus pada penggabungan IC selama modernisasi metode USP. Kesetaraan kolom pemisah dibahas, dan bagaimana hal ini membuat laboratorium lebih fleksibel dengan menerapkan kolom alternatif untuk metode analisis sesuai dengan persyaratan USP.

Klik untuk langsung menuju ke topik:

USP General Chapters dan Monographs
USP panduan validasi kromatografi, kualifikasi, dan kesesuaian sistem
Spesifikasi dan persyaratan untuk analisis farmasi berkualitas tinggi
Kolom analitis: bagian penting dari metodologianalytical
USP kriteria penerimaan metode USP untuk kolom
Studi kesetaraan kolom yang berhasil oleh Metrohm
Pentingnya kesetaraan kolom untuk analisis farmasi

USP General Chapters and Monographs

USP memberikan standar kualitas untuk obat-obatan yang aman, bahan farmasi, suplemen makanan, dan produk makanan. Asumsi dan definisi dasar dirangkum dalam bab “Pemberitahuan Umum dan Persyaratan”. “Monograf” dan “Bab Umum” menjelaskan prosedur pengujian dan kriteria penerimaan atau panduan umum untuk memastikan identitas, kualitas, dan kemurnian produk.

Panduan USP untuk validasi kromatografi, kualifikasi, dan kesesuaian sistem

Bab Umum <621> [18] (serta <1065> [19] dan <1225> [20]) berfokus pada validasi dan kualifikasi metode kromatografi, termasuk IC. Ini juga menetapkan persyaratan dan kerangka kerja untuk pengujian kesesuaian sistem.

Uji kesesuaian sistem merupakan bagian integral dari prosedur analitis. Pengujian ini memastikan kinerja sistem kromatografi yang memadai. Kepatuhan terhadap kriteria kesesuaian sistem adalah wajib dalam seluruh prosedur kromatografi. Analisis sampel hanya dapat diterima jika kesesuaian sistem telah dibuktikan.

Spesifikasi dan persyaratan untuk analisis farmasi berkualitas tinggi

Proses validasi dan kualifikasi keseluruhan metode USP untuk menentukan analit yang dijelaskan dalam Monograf dan Bab Umum sangat kompleks dan mendasari pedoman ketat seperti yang telah disebutkan.

Prosedur kromatografi umum yang ditentukan dalam metode USP ini melibatkan banyak rincian tentang sistem dan kondisi kromatografi. Untuk kondisi ini, uji kesesuaian sistem menunjukkan bahwa metode kromatografi kuat dan valid untuk mengukur analit yang diinginkan. Pengujian tersebut mencakup pengukuran sampel dan standar berulang yang harus sesuai dengan kriteria penerimaan serta memenuhi kriteria kinerja metode [18,21] seperti yang dijelaskan di bawah ini:

jumlah pelat teoritis (N, ukuran efisiensi kolom)
tailing factor (juga disebut faktor simetri A_S, ukuran asimetri puncak)
resolution (R_S, menggambarkan kualitas pemisahan))
deviasi standar relatif – ukuran keterulangan sistem yang dihitung dari serangkaian pengukuran berturut-turut selama tidak kurang dari tiga, namun hingga enam injeksi atau penerapan larutan referensi

Program perangkat lunak kromatografi modern (misalnya MagIC Net) memfasilitasi prosedur perhitungan keseluruhan parameter ini. Namun, prosedur validasi lengkapnya ketat, melelahkan, dan sangat rumit.

Kolom analitis: bagian penting dari metodologi

Mengingat parameter metodologis, jelas bahwa kolom adalah bagian penting dari metode ini. Hal ini ditentukan oleh dimensi dan pengepakan kolom (atau klasifikasi grup-L sesuai database USP).

Tabel 1 mencantumkan beberapa grup L yang relevan dengan analisis IC beserta deskripsinya dan contoh kolom Metrohm yang setara. Ini ditemukan di database kolom USP [22] dan juga ditentukan dalam dokumen USP bab «Reagen» [23].

Tabel 1. Kolom USP mengemas grup-L, definisi, kolom pemisahan yang sesuai dari Metrohm, dan Monograf USP jika hal ini berlaku.

Packing	Deskripsi	Kolom Metrohm yang sesuai	USP Monograph
L46	Substrat polistiren/divinilbenzena diaglomerasi dengan manik-manik lateks yang difungsikan amina kuaterner (diameter 9–11 µm).	Metrosep A Supp 1 - 250/4.6	Vorikonazol, Larutan Topikal Natrium Fluorida dan Fosfat Asam, Larutan Oral Natrium Fluorida, <345> Pengujian Asam Sitrat/Sitrat & Fosfat
L76	Bahan penukar kation lemah berbahan dasar silika, diameter 5 µm. Substrat adalah asam polibutadiena-maleat yang dipolimerisasi permukaan untuk menyediakan fungsi asam karboksilat. Kapasitas tidak kurang dari 29 µEq/kolom.	Metrosep C 4 - 250/4.0 Metrosep C 6 - 150/4.0	Kapsul Kalsium Asetat, Larutan Oral Kalium Sitrat & Asam Sitrat, Tablet Effervescent Kalium Bikarbonat untuk Larutan Oral, Tablet Effervescent Kalium dan Natrium Bikarbonat dan Asam Sitrat untuk Larutan Oral, Tablet Effervescent Kalium Bikarbonat dan Kalium Klorida untuk Larutan Oral (Kalium)
L91	Resin penukar anion kuat yang terdiri dari manik-manik polistiren/divinil benzena berpori monodisperse (diameter 3–10 µm) ditambah dengan amina kuaterner.	Metrosep A Supp 10 - 250/4.0 Metrosep A Supp 16 - 100/4.0 Metrosep A Supp 17 - 150/4.0 Metrosep A Supp 19 - 150/4.0	Seng Oksida, Seng Oksida Netral, Serbuk Seng Oksida, Larutan Mata Seng Sulfat, <591> Penentuan Seng, Natrium Fluorida, Gel Natrium Fluorida, Larutan Oral Natrium Fluorida, Kalium Bikarbonat dan Tablet Effervescent Kalium Klorida untuk Larutan Oral, Tablet Natrium Fluorida, Stannous Fluorida, Natrium Monofluorofosfat, Gel Stannous Fluorida, Injeksi Campuran Kalium Fosfat, Tablet Natrium Klorida untuk Larutan, Injeksi Campuran Natrium Fosfat
L97	Resin penukar kation lemah terdiri dari inti yang sangat berikatan silang dengan partikel berpori berukuran 5,5 µm yang memiliki ukuran pori 2000 Å dan terdiri dari etilvinilbenzena yang berikatan silang dengan 55% divinilbenzena. Substrat dicangkokkan permukaannya dengan gugus fungsi asam karboksilat. Kapasitas tidak kurang dari 2400 µEq/kolom (4 mm x 25 cm).	Metrosep C Supp 2 - 250/4.0	Injeksi Campuran Natrium Bikarbonat, Injeksi Campuran Natrium Fosfat
L105	Resin penukar anion kuat yang terdiri dari partikel supermakropori (2000 Å) berikatan silang tinggi berukuran 9 µm yang difungsikan dengan lateks berikatan silang sangat rendah (0,2%) untuk menghasilkan situs ion amonium kuaterner alkil.	Metrosep A Supp 4 - 250/4.0	Natrium Nitrit

Kriteria penerimaan metode USP untuk kolom

Pertama, kolom harus ditetapkan ke kategori L tertentu. Bahan untuk setiap kelompok atau kategori L memiliki sifat dan fisiokimia kolom tertentu (lihat Tabel 1 untuk contohnya). Ini harus sesuai dengan sifat dan kimia kolom dari kolom pemisahan yang dimaksud. Kategori grup-L dapat mencakup kolom berbeda dari satu penyedia atau dari produsen berbeda.

Jika USP menetapkan kolom individual ke grup L, maka kondisi yang dijelaskan dalam Monograf dapat memenuhi syarat (misalnya, penentuan seng oksida menurut USP <591> [24]; AN-U-076) dijelaskan sebelumnya. Grup L ditentukan untuk setiap metode IC—bukan kolom tertentu. Hal ini memungkinkan beberapa fleksibilitas pengguna tergantung pada preferensi mereka ketika memilih kolom dari grup L yang sama untuk kualifikasi metode (Tabel 1).

Kesetaraan kolom

Kesetaraan kolom kini memungkinkan laboratorium dan produsen untuk memenuhi syarat kolom untuk metode kromatografi yang divalidasi. Gambar 1 menunjukkan prosedur umum.

Ada dua opsi untuk melakukan pengujian kesetaraan kolom tanpa memerlukan validasi penuh:

pengguna memilih kolom yang termasuk dalam grup L yang sama seperti yang ditentukan untuk metode yang divalidasi sepenuhnya
Pengguna memilih kolom yang termasuk dalam gugus L yang memiliki karakteristik fisikokimia yang serupa dengan fase diam dan tidak ada perubahan identitas substituen.

USP General Chapter <621> [18] menentukan persyaratan untuk prosedur ini bersama dengan kriteria kesesuaian dan penerimaan metode yang divalidasi yang kolomnya perlu memenuhi syarat.

Figure 1. Illustrated schematic showing how equivalent separation columns are proposed, reviewed, approved, and accepted by the USP.

Studi kesetaraan kolom yang berhasil oleh Metrohm

Metrohm terlibat dalam melakukan validasi metode USP penuh. Salah satu contoh dijelaskan dalam Application Note AN-S-398: «fosfat dalam suntikan gabungan natrium dan kalium fosfat». Di sini, kolom Metrosep A Supp 17 - 150/4.0 digunakan untuk penentuan fosfat

Beberapa kolom Metrohm (Tabel 1) memenuhi syarat untuk metode USP dalam proses kesetaraan kolom. Contoh lain termasuk validasi Metrosep A Supp 4 - 250/4.0 kolom untuk pengujian nitrit dalam natrium nitrit (AN-S-400) atau Metrosep A Supp 1 kolom untuk kuantifikasi vorikonazol seperti yang ditunjukkan secara lebih rinci di bawah.

Contoh aplikasi: analisis vorikonazol

Metrosep A Supp 1 kolom telah memenuhi syarat oleh USP untuk analisis Senyawa Terkait Vorikonazol F. Vorikonazol adalah obat yang digunakan untuk mengobati infeksi jamur serius [25]. Tabel 2 mencantumkan semua persyaratan USP dan parameter metode serta karakteristik kinerja yang dicapai untuk studi kesetaraan kolom.

Penelitian dilakukan dengan 940 Professional IC Vario sistem menggunakan solusi Vorikonazol Terkait Senyawa F RS. Konsentrasi yang berbeda (2,5–5 µg/mL) dan komposisi digunakan untuk pengujian kesesuaian sistem (Tabel 3). Selain itu, sampel larutan vorikonazol diuji (Nomor Batch: VZFP22009, Tabel 4).

Tabel 2. Persyaratan mengenai kesetaraan kolom untuk Senyawa F Terkait Vorikonazol sesuai USP.

Senyawa F Terkait Vorikonazol sesuai USP - Tabel Ringkasan
Parameter	USP Monograph	Metrohm
Eluent (Fasa Gerak)	Larutan natrium hidroksida: 470 g/L natrium hidroksida dalam ai Fase gerak: metanol, air, dan larutan Natrium hidroksida (500:1500:0,175)	Sama seperti Monograf USP
Larutan stok klorida	86 μg/mL natrium klorida dalam air	Sama seperti Monograf USP
Larutan stok standar	250 μg/mL Senyawa Terkait USP Vorikonazol F RS. Larutkan dalam 50% volume akhir dengan metanol dan encerkan dengan fase gerak hingga volume.	Sama seperti Monograf USP
Larutan Standar	5,0 μg/mL Senyawa Terkait USP Vorikonazol F RS dari larutan stok Standar dalam campuran metanol dan fase gerak (50:50)	Sama seperti Monograf USP
System suitability solution A	5 μg/mL Senyawa Terkait Vorikonazol USP F RS dari larutan stok Standar dan 1,7 μg/mL natrium klorida dalam campuran metanol dan fase gerak (50:50)	Sama seperti Monograf USP
System suitability solution B	2,5 μg/mL Senyawa Terkait USP Vorikonazol F RS dari larutan Standar dalam fase gerak	Sama seperti Monograf USP
Sample Solution	5 mg/mL Vorikonazol. Larutkan dalam 50% volume akhir dengan metanol dan encerkan dengan fase gerak hingga volume.	Sama seperti Monograf USP
Detection	Conductivity dengan suppression	Sama seperti Monograf USP: Conductivity dengan suppression (MSM_ChS)
Column	4 mm × 5 cm guard column dan 4 mm × 25 cm analytical column; both packing L46	Metrosep A Supp 1 Guard/4.6 (P/N: 6.1005.340) Metrosep A Supp 1 - 250/4.6 (P/N: 6.1005.300)
Flow Rate	1.0 mL/min	Sama seperti Monograf USPh
Injection Volume	20 µL	Sama seperti Monograf USP
Run Time	tidak disebutkan	60 menit
Temperatur Kolom	40 °C	Sama seperti Monograf USP

Sistem IC Metrohm menggunakan Metrosep A Supp 1 - 250/4.6 Sistem IC Metrohm yang menggunakan kolom memenuhi kriteria kesesuaian USP untuk analisis Senyawa Terkait Vorikonazol F RS (Tabel 3).

Tabel 3. Penentuan kesesuaian sistem IC Metrohm dibandingkan dengan persyaratan Monograf USP untuk analisis Senyawa Terkait Vorikonazol F (VRC-F).

System suitability (n=6)	USP Monograph	Metrohm
Tailing factor (System suitability solution B)	NMT 2.0 for VRC-F peak	1.219 (PASS)
Relative Standard Deviation (System suitability solution B)	NMT 10.0% for VRC-F ion	2.347% (PASS)
Resolution between VRC-F ion and Chloride ion (System suitability solution A)	NLT 3.5	11.41 (PASS)

Penelitian ini juga memenuhi kriteria penerimaan analisis sampel vorikonazol (Tabel 4)dan diterima oleh USP. Contoh kromatogram Senyawa Terkait Vorikonazol F ditunjukkan pada Gambar 2.

Tabel 4. Kriteria penerimaan USP untuk analisis vorikonazol dengan kromatografi ion..

Voriconazole (Batch No: VZFP22009)	USP Monograph	Metrohm
Mean Sample results: Triplicate Sample preparations (Voriconazole Sample solution)	NMT 0.1%	0.04% (PASS)

Figure 2. Example chromatogram of a USP reference standard for Voriconazole Related Compound F determined with the Metrosep A Supp 1 column.

Pentingnya kesetaraan kolom untuk analisis farmasi

Sistem kromatografi ion laboratorium khusus mungkin berbeda dari sistem yang divalidasi USP. Hal ini sebagian besar disebabkan oleh kolom kromatografi yang digunakan. Inisiatif modernisasi USP Monograph telah memperluas pilihan kolom kepada para peneliti. Hal ini sangat bermanfaat bagi industri farmasi.

Studi kesetaraan kolom memungkinkan kolom analitik alternatif digunakan untuk analisis farmasi berkualitas tinggi. Hal ini menghemat banyak waktu dan tenaga dengan menghindari prosedur validasi metode penuh yang memakan waktu beberapa minggu. Pada akhirnya, keakuratan dan keandalan hasil analisis tetap tercapai sesuai metode yang divalidasi.

Metrohm menawarkan beberapa aplikasi tervalidasi USP serta kolom alternatif untuk metode USP tervalidasi yang disetujui oleh studi kesetaraan kolom yang berhasil.

[1] The United States Pharmacopeial Convention. Monograph Modernization History. https://www.usp.org/get-involved/partner/monograph-modernization-history (accessed 2023-09-13).

[2] Kappes, S. When HPLC Fails: IC in Food, Water, and Pharmaceutical Analysis. White paper, WP-045EN, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2019.

[3] Kappes, S.; Steinbach, A.; Ruth, K. IC: The All-Rounder in Pharmaceutical Analysis. White paper, WP-019EN, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2017.

[4] Metrohm AG. Pharmaceutical Analysis: Quality Control of Pharmaceuticals. Brochure, 8.000.5139EN, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2015.

[5] Subramanian, N. H.; Wille, A. Inline Sample Preparation – An Effective Tool for Ion Analysis in Pharmaceutical Products. Metrohm AG, 8.000.6010.

[6] Metrohm AG. Bring Your USP Methods up to Date! - The Benefits of Metrohm Ion Chromatography for Your Analytics of APIs, Impurities, and Excipients. Brochure, 8.000.5436EN, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2023.

[7] Jenke, D. Application of Ion Chromatography in Pharmaceutical and Drug Analysis. Journal of Chromatographic Science 2001, 49 (7), 524–539. DOI:10.1093/chrsci/49.7.524

[8] Metrohm AG. Quality Control of Dialysis Concentrates; Application Note, AN-D-003; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2022.

[9] Metrohm AG. Qualitative Determination of Anions in Urine to Verify Adulteration; Application Note, AN-S-215; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2005.

[10] Metrohm AG. Mannitol, Rhamnose, Lactulose and Lactose in Blood Serum with Pulsed Amperometric Detection (PAD); Application Note, AN-P-063; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2016.

[11] Metrohm AG. Standard Methods in Water Analysis; Application Bulletin, AB-221; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2015.

[12] Bruttel, A.; Seifert, N.; Läubli, M.; et al. Monograph: Analysis of Water Samples and Water Constituents with Metrohm Instruments, 8.108.5071EN; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2021.

[13] Ruth, K. Measuring Organic Acids and Inorganic Anions with Ion Chromatography Mass Spectrometry. White paper WP-086EN; Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2023.

[14] Metrohm AG. Trace Monitoring in Distilled Water Using Ion Chromatography; Application Note, AN-Q-008; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2015.

[15] Ruth, K.; Pfundstein, P.; Martin, C.; et al. IC–ICP–MS for Monitoring the Fate of Iodinated X-Ray Contrast Media after Ozonation (TA-052). LCGC International - The Column 2015, 11 (16).

[16] Pfundstein, P.; Martin, C.; Schulz, W.; et al. IC–ICP-MS Analysis of Gadolinium-Based MRI Contrast Agents (TA-023). LCGC International - The Application Notebook 2011.

[17] Metrohm AG. Wastewater Analysis in Treatment Plants. Brochure, 8.000.5142EN, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2015.

[18] U. S. Pharmacopeia/National Formulary. General Chapter, <621> Chromatography; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99380_07_01

[19] U. S. Pharmacopeia/National Formulary. General Chapter, <1065> Ion Chromatography; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M897_01_01

[20] U. S. Pharmacopeia/National Formulary. General Chapter, <1225> Validation of Compendial Procedures; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99945_04_01

[21] Schäfer, H.; Läubli, M. Monograph Ion Chromatography, 8.108.5077EN; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2023.

[22] U. S. Pharmacopeia. Chromatographic Columns; USP: Rockville, MD, USA, 2023.

[23] U. S. Pharmacopeia/National Formulary. Reagents; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023.

[24] U. S. Pharmacopeia/National Formulary. <591> Zinc Determination. In General Chapter; USP/NF, Rockville, MD, USA; DOI:10.31003/USPNF_M99350_05_01

[25] ASHP. AHFS® Patient Medication Information™: Voriconazole, 2023.