Los microorganismos se encuentran entre las formas de vida más diversas de la Tierra. Presentan características únicas y desempeñan papeles cruciales en los ciclos ecológicos de nutrientes y materiales. Los microorganismos son esenciales para la producción de alimentos, incluidos el yogur y las bebidas alcohólicas, y en la remediación de contaminantes ambientales. Además, la modificación genética de microorganismos facilita la producción de productos valiosos como la insulina. Dada su importancia, muchos países mantienen repositorios especializados como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y la Colección Suiza de Microorganismos (SCM) para preservar y acumular microorganismos.
Tradicionalmente, la identificación de microorganismos como las bacterias implicaba secuenciar su composición genética. Este costoso proceso requiere capacitación y equipo especializados. Sin embargo, la espectroscopia Raman es una herramienta potencial para identificar bacterias y detectar metabolitos producidos por el cultivo, proporcionando información sobre los bioprocesos y la función en un ecosistema. La cartera de productos Raman de laboratorio de Metrohm incluye opciones para la interrogación Raman de 785 nm y 1064 nm de cultivos bacterianos.
La espectroscopia Raman se utiliza en microbiología por su potencial para identificar bacterias y monitorear metabolitos. Todos los organismos vivos de la Tierra están compuestos de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo, azufre y otros oligoelementos. Estos elementos se unen para formar ADN, lípidos, aminoácidos y otras biomoléculas. La composición de estas biomoléculas varía entre organismos. Algunas bacterias almacenan metabolitos (por ejemplo, polifosfato y glucógeno) dependiendo de las condiciones ambientales. Los espectros Raman de las bacterias reflejan estas diferencias químicas, lo que permite su identificación y dilucidar sus funciones en los bioprocesos.
El medio de cultivo agar caldo de lisogenia (LB) se preparó disolviendo polvo de LB y polvo de agar en agua desionizada siguiendo las especificaciones del fabricante (Sigma-Aldrich). Después de esterilizar en autoclave, la mezcla se vertió en placas Petri de vidrio esterilizadas y se enfrió. Una vez que el agar LB se solidificó, se presionaron los dedos sobre la superficie para transferir las bacterias al medio. Luego, la placa de Petri se incubó a temperatura ambiente hasta que se observaron colonias bacterianas.
La placa de Petri se colocó en un portasondas BAC150B y un microscopio de video BAC151C, y se recolectaron espectros Raman de las colonias y los medios de cultivo (Figura 1). Los parámetros de adquisición y configuración del instrumento se resumen en Tabla 1.
| Instrumento | Porta sonda (BAC150B) |
Microscopio de vídeo (BAC151C) |
|---|---|---|
| i-Raman Prime 785 | BAC102-785HT | Objetivo 50x |
| i-Raman EX | BAC102-1064HT | Objetivo 50x |
| Software BWSpec | ||
| Parámetros de adquisición* | ||
| Potencia del láser (%) | 30–100 | |
| Tiempo de integración | 3–60 segundos | |
| Promedios | 3–5 | |
Espectros Raman de la colonia bacteriana (Figura 2) contenía picos que representaban varios aminoácidos (1001, 1156 y 1654 cm-1) y ADN (723, 669 y 1337 cm−1). Estas características, comúnmente observadas en bacterias, confirman el éxito de i-Raman Prime 785 en el análisis microbiano [1].
La excitación Raman a 785 nm proporcionó picos más fuertes y nítidos que la excitación a 1064 nm. Esto se atribuye al mayor poder de dispersión del láser de 785 nm y a la mejor resolución del detector CCD de silicio en comparación con el detector de matriz InGaAs con una menor densidad de píxeles. Sin embargo, la excitación de 1064 nm puede mitigar la fluorescencia asociada con sustratos de colores oscuros, como el agar chocolate o el agar sangre.
Bacterias con dos morfologías distintas (blanca y amarilla) se formaron en el agar LB, lo que sugiere que son organismos diferentes (Figura 3). Los espectros Raman de estas dos bacterias fueron marcadamente diferentes, y las bacterias amarillas mostraron picos asociados con pigmentos de colores que se encuentran comúnmente en plantas y microorganismos [1].
El análisis de componentes principales (PCA) puede ser adecuado para diferenciar bacterias con características fenotípicas distintas en pequeñas comunidades bacterianas, como en este experimento (Figura 4). Sin embargo, los investigadores suelen desarrollar algoritmos de aprendizaje automático para detectar diferencias sutiles en picos menores para una caracterización más detallada.
- El uso de placas Petri de vidrio evita las contribuciones espectrales del plástico.
- Los espectros Raman de las colonias pueden cambiar después del almacenamiento a baja temperatura y el cultivo prolongado.
- Se utiliza un microscopio de vídeo con excitación láser de 1064 nm para visualizar el punto láser.
La espectroscopia Raman se puede utilizar para adquirir espectros de colonias bacterianas directamente de medios de cultivo sólidos. Los espectros Raman recopilados con excitación de 785 nm proporcionan una mayor resolución, mientras que la excitación a 1064 nm reduce la fluorescencia de los medios de cultivo.
Las colonias bacterianas simples se pueden diferenciar utilizando modelos PCA, pero se pueden utilizar algoritmos avanzados de aprendizaje automático para caracterizar comunidades microbianas más complejas.
Los usuarios pueden exportar fácilmente los archivos espectrales de los instrumentos i-Raman para un análisis posterior utilizando el software BWSpec u otras herramientas de aprendizaje automático más avanzadas.
- Paret, M. L.; Sharma, S. K.; Green, L. Metal. Caracterización bioquímica de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas asociadas a plantas con espectroscopia Micro-Raman. Espectroscopia de aplicaciones 2010, 64 (4), 433–441. DOI:10.1366/000370210791114293
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